Vijesti

Tradicionalne dijagnostičke strategije za otkrivanje zaraznih bolesti zahtijevaju upotrebu stacionarnih instrumenata koji nisu prikladni za testiranje na mjestu liječenja (POCT).Nova mikrofluidika je vrlo minijaturizirana, automatizirana i integrirana tehnologija koja je potencijalna alternativa tradicionalnim metodama za brzu, jeftinu i točnu dijagnostiku na licu mjesta.Molekularne dijagnostičke metode naširoko se koriste u mikrofluidnim uređajima kao najučinkovitije metode za detekciju patogena.Ovaj pregled sažima novi napredak u mikrofluidnoj molekularnoj dijagnostici zaraznih bolesti iz akademske i industrijske perspektive.Prvo opisujemo tipičnu obradu nukleinskih kiselina na čipu, uključujući prethodnu obradu uzorka, pojačanje i očitavanje signala.Zatim se uspoređuju karakteristike, prednosti i nedostaci četiri vrste mikrofluidnih platformi.Zatim ćemo raspravljati o upotrebi digitalnih testova za apsolutnu kvantifikaciju nukleinskih kiselina.I klasični i noviji komercijalni mikrofluidički uređaji za molekularnu dijagnostiku sažeti su kao dokaz trenutnog stanja na tržištu.Na kraju, predlažemo buduće smjerove za mikrofluidnu dijagnostiku zaraznih bolesti.
Zarazne bolesti uzrokuju patogeni, uključujući bakterije, viruse i parazite, koji su rasprostranjeni diljem svijeta.Za razliku od drugih bolesti, uzročnici se brzo inficiraju i šire između ljudi i životinja domaćina putem inokulacije, zraka i vode [1].Prevencija zaraznih bolesti ključna je kao javnozdravstvena mjera.Tri glavne strategije za borbu protiv zaraznih bolesti: (1) kontrolirati izvor infekcije;(2) prekid prijenosnog puta;(3) zaštita osjetljive populacije.Među glavnim strategijama, kontrola izvora infekcije smatra se najvažnijom strategijom zbog svoje pogodnosti i niske cijene.Brza dijagnoza, izolacija i liječenje zaraženih pojedinaca su ključni, zahtijevaju brze, osjetljive i točne dijagnostičke strategije [2].Trenutna dijagnoza zaraznih bolesti obično kombinira klinički pregled temeljen na znakovima i simptomima i laboratorijske studije poput stanične kulture i molekularne dijagnostike, što zahtijeva obučeno osoblje, radno intenzivne postupke i skupu opremu za testiranje [3, 4].Prevencija izbijanja zaraznih bolesti zahtijeva brzu, jeftinu i točnu lokalnu dijagnozu, posebno u područjima s ograničenim resursima gdje su zarazne bolesti česte i ozbiljne [5], kao i liječenje u divljini ili na bojnom polju, gdje su hitni slučajevi nepredvidivi..medicinska skrb je ograničena [6].U tom kontekstu, mikrofluidika je tehnologija koja kombinira tehnologije mikroelektromehaničkih sustava, nanotehnologiju ili znanost o materijalima za preciznu manipulaciju tekućinama [7,8,9,10], pružajući nove mogućnosti za otkrivanje na mjestu (POCT).) infektivni agensi izvan bolnica i laboratorija.U usporedbi s tradicionalnom dugotrajnom dijagnostikom, mikrofluidna tehnologija nudi uštedu uzoraka i troškova za molekularnu dijagnostiku tijekom izbijanja bolesti.Globalno širenje koronavirusne bolesti 2019. (COVID-19) uzrokovano je teškim akutnim respiratornim sindromom koronavirusom 2 (SARS-CoV-2), pa se ponovno ističe važnost mikrofluidike za pravovremenu prevenciju i kontrolu pandemije [11, 12]. , 13].Za razliku od tradicionalne dijagnostike, mikrofluidna POCT koristi male prijenosne uređaje u rasponu od stolnih analizatora do malih bočnih test traka za testiranje blizu točke uzorkovanja [14].Ovi testovi imaju jednostavnu pripremu uzorka ili nikakvu pripremu uzorka, brzo pojačanje signala i osjetljiva očitavanja signala što rezultira kratkim trajanjem i točnim rezultatima unutar nekoliko minuta.Dostupnost i masovna proizvodnja instrumenata za zdravstvenu njegu koji se temelje na mikrofluidima proširili su njihovu ekonomičnu i izravnu dijagnostičku primjenu izvan bolnice, u blizini pacijenta, pa čak i kod kuće.
Među postojećim strategijama dijagnosticiranja zaraznih bolesti, molekularna je dijagnostika jedna od najosjetljivijih [15, 16].Osim toga, molekularna dijagnostika često se koristi kao zlatni standard za kontinuirano otkrivanje COVID-19, omogućujući izravno otkrivanje virusno specifičnih regija RNK ili DNK prije početka imunološkog odgovora [17, 18].U ovom pregledu predstavljamo najnoviji napredak u procesima molekularne dijagnostike zaraznih bolesti koji se temelje na mikrofluidici, iz akademske perspektive do budućih industrijskih perspektiva (slika 1).Počet ćemo s tri ključna koraka u detekciji nukleinske kiseline: prethodna obrada uzorka na čipu, pojačanje nukleinske kiseline i očitavanje signala.Zatim smo usporedili različite vrste mikrofluidnih platformi s njihovom strukturom i funkcijom, pokazujući jedinstvene karakteristike (snage i slabosti).Dalje se raspravlja o digitalnoj detekciji nukleinske kiseline i daje se kao primjer tehnologije treće generacije za apsolutnu kvantifikaciju molekula infektivnih patogena.Osim toga, bit će predstavljeno nekoliko tipičnih i najnovijih komercijalnih POCT uređaja kako bi se pokazalo trenutno stanje mikrofluidnog POCT tržišta za molekularnu dijagnostiku.Također ćemo raspravljati i objasniti našu viziju budućih aplikacija.
Moduli mikrofluidnih čipova za detekciju nukleinskih kiselina mogu se podijeliti u tri kategorije (uzorkovanje, prepoznavanje i signalizacija) prema njihovim funkcijama [19].Među tim modulima, modul za uzorkovanje uglavnom realizira lizu uzorka i ekstrakciju nukleinske kiseline.Senzorski modul uglavnom kontrolira pretvorbu i pojačanje signala nukleinskih kiselina.Signalni modul detektira signal koji pretvara i obrađuje senzorski modul.Na temelju procesa otkrivanja nukleinskih kiselina na čipu, sažet ćemo različite čipove koji mogu ostvariti funkciju "ulaza i izlaza".
Prvi korak u detekciji nukleinske kiseline je ekstrakcija nukleinske kiseline, odnosno izdvajanje ciljne nukleinske kiseline iz izvornog uzorka.Ekstrakcija nukleinske kiseline provodi se kako bi se nukleinske kiseline pročistile od drugih molekularnih kontaminanata, osigurala cjelovitost primarne strukture molekula nukleinske kiseline i optimizirali rezultati.Ekstrakcija nukleinske kiseline zahtijeva potrebnu lizu uzorka i hvatanje nukleinske kiseline, čija kvaliteta i učinkovitost imaju veliki utjecaj na rezultate istraživanja i dijagnostike.Sve suptilne nuspojave tijekom ekstrakcije mogu ograničiti daljnje otkrivanje.Na primjer, metode lančane reakcije polimerazom (PCR) i izotermalne amplifikacije u petlji (LAMP) inhibiraju neka zaostala organska otapala kao što su etanol i izopropanol u reagensima za izolaciju nukleinskih kiselina [20].Ekstrakcija tekućina-tekućina i ekstrakcija na čvrstoj fazi su najpopularnije metode za izolaciju nukleinskih kiselina [21], međutim, ekstrakcija tekućina-tekućina na čipu je izuzetno ograničena, budući da reagensi korišteni u ekstrakciji tekućina-tekućina uzrokuju koroziju većine mikrofluidnih čipova .Ovdje ističemo metode ekstrakcije čvrste faze temeljene na mikromrežama i uspoređujemo njihove prednosti i nedostatke.
Silicij je supstratni materijal kompatibilan s nukleinskim kiselinama zbog svoje biokompatibilnosti, stabilnosti i lakoće modifikacije [22].Važno je da kada se modificira silicijevim dioksidom ili drugim materijalima, ovaj kompozit pokazuje svojstva adsorpcije negativno nabijenih nukleinskih kiselina u uvjetima niskog pH, visoke razine soli, dok eluira otopinama s visokim pH i niskim sadržajem soli.Na temelju ovog fenomena moguće je pročistiti nukleinsku kiselinu.
Različiti oblici materijala na bazi silicijevog dioksida korišteni su za ekstrakciju nukleinskih kiselina u mikrofluidici, kao što su kuglice silicijevog dioksida, prahovi, filtri od mikrovlakana i silikatne membrane [23, 24, 25, 26].Ovisno o svojstvima materijala, materijali na bazi silicija mogu se koristiti u mikrosklopovima na različite načine.Na primjer, granule silicijevog dioksida, prašci i komercijalni nanofiltri mogu se jednostavno staviti u pore ili mikrokanale mikrofluidnih čipova i pomoći ekstrahirati nukleinske kiseline iz uzoraka [27, 28, 29].Površinski modificirane silikatne membrane također se mogu koristiti za brzo pročišćavanje DNK od patogena uz nisku cijenu.Na primjer, Wang i sur.[30] Kombinacijom denaturirajućih reakcija pojačanja s izmjenom lanca posredovanom vezikulama sa membranama od silicijevog dioksida obloženim oligosaharidima kitozana, uveden je svestrani prijenosni sustav koji je uspješno detektirao 102-108 jedinica koje stvaraju kolonije.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., a prisutnost virusa bila je lako vidljiva.Powell i sur.[31] Mikronizovi temeljeni na siliciju su zatim korišteni za otkrivanje virusa hepatitisa C (HCV), virusa humane imunodeficijencije (HIV), Zika virusa i humanog papiloma virusa i automatskog razmnožavanja, u kojem je razvijen mikroreaktor od 1,3 μl za hvatanje RNA virusa.i izvrši in situ pojačanje.Osim ovih metoda, površinski modificirane mikrokolone silicijevog dioksida također igraju ključnu ulogu u ekstrakciji nukleinske kiseline, budući da geometrija i svojstva modificirajućeg materijala uvelike povećavaju učinkovitost ekstrakcije.Chen i sur.[32] predložili su mikrofluidnu platformu za izolaciju RNA niske koncentracije na temelju silicijskih mikrokolona obloženih aminokiselinom.Ovaj mikrofluidni uređaj integrira niz mikrostupova od 0,25 cm2 na silicijskoj podlozi za postizanje veće učinkovitosti ekstrakcije kroz dizajn visokog omjera površine i volumena.Prednost ovog dizajna je da mikrofluidički uređaj može postići do 95% učinkovitosti ekstrakcije nukleinske kiseline.Ove strategije temeljene na siliciju pokazuju vrijednost brzog izdvajanja nukleinskih kiselina po niskoj cijeni.U kombinaciji s mikrofluidnim čipovima, strategije ekstrakcije na bazi silicija mogu ne samo povećati učinkovitost detekcije nukleinskih kiselina, već i olakšati minijaturizaciju i integraciju analitičkih uređaja [20].
Metode magnetske separacije koriste magnetske čestice za izolaciju nukleinskih kiselina u prisutnosti vanjskog magnetskog polja.Često korištene magnetske čestice uključuju Fe3O4 ili γ-Fe2O3 magnetske čestice obložene silicijem, amino i karboksilom [33,34,35,36].Karakteristika magnetskih čestica u usporedbi s SPE metodama temeljenim na siliciju je jednostavnost manipulacije i kontrole s vanjskim magnetima.
Koristeći elektrostatsku interakciju između nukleinskih kiselina i silicija, u uvjetima visoke soli i niskog pH, nukleinske kiseline se adsorbiraju na površini magnetskih čestica obloženih silicijevim dioksidom, dok se u uvjetima niske soli i visokog pH molekule mogu isprati. opet..Magnetske kuglice obložene silicijevim dioksidom omogućuju ekstrakciju DNK iz uzoraka velikog volumena (400 μL) korištenjem magnetski kontroliranog gibanja [37].Kao demonstraciju, Rodriguez-Mateos et al.[38] koristili su podesive magnete za kontrolu prijenosa magnetskih kuglica u različite komore.Na temelju magnetskih čestica obloženih silicijevim dioksidom, 470 kopija/mL SARS-CoV-2 genomske RNA može se ekstrahirati iz uzoraka otpadne vode za LAMP detekciju reverzne transkripcije (RT-LAMP), a odgovor se može očitati unutar 1 sata.golim okom (sl. 2a).
Uređaji na bazi magnetskih i poroznih materijala.Konceptualni dijagram mikrofluidnog uređaja IFAST RT-LAMP za detekciju RNK SARS-CoV-2 (prilagođeno iz [38]).b Centrifugalni mikro uređaj za dSPE nukleinske kiseline bukalnog obriska (prilagođeno iz [39]).c Ugrađeni koncentrator uzoraka s vlastitim napajanjem pomoću FTA® kartice (prilagođeno iz [50]).d Filter papir Fusion 5 modificiran hitozanom (prilagođeno iz [51]).SARS-CoV-2 teški akutni respiratorni sindrom, koronavirus 2, izotermna amplifikacija posredovana petljom reverzne transkripcije RT-LAMP, tehnološki partneri FTA pronalazača, NA nukleinska kiselina
Pozitivno nabijene magnetske čestice idealne su za pričvršćivanje fosfatne okosnice nukleinske kiseline.Pri određenoj koncentraciji soli, negativno nabijene fosfatne skupine nukleinskih kiselina mogu biti pozitivno nabijene na površini čestica magnetskog kompozita.Stoga su za ekstrakciju nukleinskih kiselina razvijene magnetske nanočestice s hrapavom površinom i velikom gustoćom amino skupina.Nakon magnetske separacije i blokiranja, magnetske nanočestice i kompleksi DNA mogu se izravno koristiti u PCR-u, što eliminira potrebu za složenim i dugotrajnim operacijama pročišćavanja i eluiranja [35].Magnetske nanočestice obložene negativnim karboksilnim skupinama također su korištene za odvajanje nukleinskih kiselina adsorbiranih na površinama u otopinama polietilen glikola i natrijevog klorida visoke koncentracije [36].S ovim površinski modificiranim magnetskim zrncima ekstrakcija DNK je kompatibilna s naknadnim umnožavanjem.Dignan i sur.[39] opisali su automatiziranu i prijenosnu centrifugalnu mikrofluidnu platformu za predtretman nukleinske kiseline, omogućujući netehničkom osoblju da je koristi na licu mjesta.Osim toga, kompatibilnost izolirane DNK s LAMP-om, metodom koja je vrlo prikladna za analizu nukleinske kiseline na mjestu liječenja, dodatno pokazuje minimalne zahtjeve za opremom i prikladnost za kolorimetrijske testove (Slika 2b).
Metode magnetskih kuglica nude mogućnost automatizirane ekstrakcije, od kojih neke postoje u komercijalnim automatiziranim ekstraktorima nukleinskih kiselina [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, SAD), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kina) i Biomek®;Beckman (Miami, SAD).), Florida, SAD)].Prednosti kombiniranja magnetskih kuglica s mikrofluidikom mogu se koristiti za učinkovitu automatiziranu ekstrakciju nukleinskih kiselina, što bi potencijalno moglo unaprijediti razvoj molekularne dijagnostike;međutim, kombinacija magnetskih kuglica s mikrofluidikom i dalje se uvelike oslanja na složene kontrolne sustave za preciznu manipulaciju magnetskim kuglicama, što objašnjava popularnost komercijalnih proizvoda koji su glomazni i skupi, što ograničava daljnju primjenu magnetskih kuglica u POCT-u.
Nekoliko poroznih materijala kao što su modificirani filteri od nitroceluloze, kartice Finders Technology Associates (FTA), filter papiri na bazi polietersulfona i materijali obloženi glikanom također su korišteni za detekciju nukleinskih kiselina [40, 41, 42, 43, 44].Porozni vlaknasti materijali poput vlaknastog papira prvi su put korišteni za izolaciju DNK fizičkim zapetljavanjem dugolančanih molekula DNK s vlaknima.Male pore dovode do snažnog fizičkog ograničenja DNA molekula, što pozitivno utječe na ekstrakciju DNA.Zbog različitih veličina pora vlaknastog papira, učinkovitost ekstrakcije ne može zadovoljiti potrebe umnožavanja DNA [45, 46].FTA kartica je komercijalni filter papir koji se koristi u području forenzičke medicine i široko se koristi u drugim područjima molekularne dijagnostike.Upotrebom celuloznog filter papira impregniranog raznim kemikalijama za lizu staničnih membrana u uzorku, oslobođena DNK zaštićena je od razgradnje do 2 godine.Nedavno je razvijen impregnirani celulozni papir za molekularnu detekciju različitih patogena, uključujući SARS-CoV-2, lišmaniozu i malariju [47,48,49].HIV u izoliranoj plazmi izravno se lizira, a virusna nukleinska kiselina obogaćena je FTA® protočnom membranom ugrađenom u koncentrator, što omogućuje učinkovitu proizvodnju nukleinske kiseline [50] (slika 2c).Glavni problem s detekcijom nukleinske kiseline pomoću FTA kartica je taj što kemikalije poput gvanidina i izopropanola inhibiraju naknadne reakcije pojačanja.Kako bismo riješili ovaj problem, razvili smo filter papir modificiran hitozanom Fusion 5, koji kombinira prednosti fizičkog ispreplitanja molekula DNK i vlaknastog filter papira i elektrostatske adsorpcije DNK na spojeve modificirane hitozanom kako bi se postigla visoko učinkovita ekstrakcija nukleinske kiseline ..filtarska vlakna [51] (slika 2d).Slično, Zhu et al.[52] demonstrirali su hitosanom modificiranu PCR metodu koja se temelji na in situ kapilarnom mikrofluidnom sustavu za brzu izolaciju i detekciju RNA Zika virusa.Nukleinske kiseline mogu se adsorbirati/desorbirati u mješovitom lizat/PCR mediju, na temelju svojstva prekidača za uključivanje/isključivanje kitozana.uključivanje i isključivanje”, reagira na pH.
Kao što je gore spomenuto, ove strategije kombiniraju prednosti različitih materijala čvrste faze i povećavaju učinkovitost ekstrakcije nukleinskih kiselina u mikrofluidici.U praktičnim primjenama uporaba ovih materijala u velikim količinama je neekonomična, a odgovarajuća površinska obrada ili modifikacija površine uobičajenih materijala s ovim materijalima također može očuvati njihovu funkciju.Stoga se vjeruje da provedba ovih strategija nakon pilot studije može smanjiti troškove.
Ispitivanje nukleinske kiseline na mikrofluidnim platformama često koristi male volumene uzorka (< 100 µl), stoga zahtijeva umnožavanje ciljnih nukleinskih kiselina sa specifičnim probama za konverziju u signal koji je prikladan za nizvodnu detekciju (optičku, električnu i magnetsku) [53, 54]. Ispitivanje nukleinske kiseline na mikrofluidnim platformama često koristi male volumene uzorka (< 100 µl), stoga zahtijeva umnožavanje ciljnih nukleinskih kiselina sa specifičnim probama za konverziju u signal koji je prikladan za nizvodnu detekciju (optičku, električnu i magnetsku) [53, 54]. Pri testiranju nukleinskih kiselina na mikrožidkostnim platformama često se koriste manji volumeni uzoraka (< 100 mkl), stoga je potrebno pojačanje nukleinskih kiselina uz pomoć posebnih zona za pretvorbu u signal pogodan za naknadno otkrivanje (optičkog, električnog i magnetskog) [53, 54]. Pri testiranju nukleinskih kiselina na mikrofluidnim platformama često se koriste mali volumeni uzoraka (<100 µL), tako da je potrebno umnožavanje ciljnih nukleinskih kiselina posebnim probama kako bi se pretvorilo u signal prikladan za kasniju detekciju (optičku, električnu i magnetsku). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 通常 使用 小样本量 （<100 ul） ， 因此 需要 使用 特定 扩增 扩增 目标 ， 以 转换 便于 便于 检测 检测 （、 电学 和 磁学）） 信号 [53, 54, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 使用 小样本量 （（<100 ul） ， 因此 需要 特定 探针 目标 目标 ， 以 转换 为 下游 （光学 、 、 磁学） 的 [53, 54, 54, 54, 54 ]。 Obnavljanje nukleinskih kiselina na mikrožidkostnim platformama obično koristi male volumene uzoraka (<100 mkl), što zahtijeva pojačanje ciljnih nukleinskih kiselina uz pomoć posebnih zona za pretvorbu u signale za naknadno otkrivanje (optički, električni i magnetski) [53, 54]]. Detekcija nukleinskih kiselina na mikrofluidnim platformama obično koristi male volumene uzorka (<100 μl), što zahtijeva umnožavanje ciljnih nukleinskih kiselina s posebnim probama kako bi se pretvorile u signale za naknadnu detekciju (optičke, električne i magnetske) [53, 54]] .Amplifikacija nukleinske kiseline u mikrofluidici također može ubrzati reakcije, optimizirati granice detekcije, smanjiti zahtjeve za uzorkom i poboljšati točnost detekcije [55, 56].Posljednjih godina, s ostvarenjem brze i točne detekcije, različite metode amplifikacije nukleinskih kiselina primijenjene su u mikrofluidici, uključujući PCR i neke izotermne reakcije amplifikacije.Ovaj odjeljak će sažeti metode za detekciju nukleinske kiseline temeljene na mikrofluidnim sustavima.
PCR je simulacija procesa replikacije DNK organizma, čija je teorija detaljno opisana drugdje i o njoj se ovdje neće raspravljati.PCR može pojačati vrlo malu količinu ciljne DNA/RNA eksponencijalnom brzinom, čineći PCR moćnim alatom za brzo otkrivanje nukleinskih kiselina.Posljednjih desetljeća razvijeni su mnogi prijenosni mikrofluidni uređaji opremljeni sustavima PCR termičkog ciklusa kako bi se zadovoljile potrebe dijagnostike na mjestu liječenja [57, 58].PCR na čipu može se podijeliti u četiri vrste (konvencionalni, kontinuirani protok, prostorno promijenjeni i konvektivni PCR) prema različitim metodama kontrole temperature [59].Na primjer, Gee et al.[60] razvili su metodu kvantitativne PCR izravne reverzne transkripcije (RT-qPCR) na vlastitoj mikrofluidnoj platformi za multipleksnu detekciju SARS-CoV-2, virusa influence A i B u uzorcima brisa grla (Slika 3a).Park i sur.[61] napravili su jednostavan čip za analizu patogena integracijom tankog filma PCR, elektroda i mikrofluidnog modula na bazi polidimetilsiloksana koji se upravlja prstom.Međutim, oba rada utjelovljuju zajedničke nedostatke konvencionalne PCR.PCR zahtijeva termalni ciklus, što ograničava daljnju minijaturizaciju uređaja i smanjuje vrijeme testiranja.
Razvoj mikrofluidne PCR bazirane na kontinuiranom protoku i PCR-a s promjenom prostora ključan je za rješavanje ovog problema.Korištenjem dugog zmijolikog kanala ili kratkog ravnog kanala, PCR kontinuiranog protoka može osigurati brzo pojačanje aktivnim kruženjem reagensa u tri zone predgrijavanja s pumpom izvan čipa.Ova operacija uspješno izbjegava prijelaznu fazu između različitih reakcijskih temperatura i time značajno smanjuje vrijeme ispitivanja [62] (Sl. 3b).U drugoj studiji Junga i sur.[63] predložili su novi rotirajući PCR genetski analizator koji kombinira karakteristike fiksne i protočne PCR za ultrabrzu i multipleksnu reverznu transkripciju PCR (slika 3c).Za amplificiranje nukleinske kiseline, PCR mikročip će se rotirati kroz tri grijaća bloka na različitim temperaturama: 1. Denaturacijski blok 94°C, 2. Blok žarenja na 58°C, 3. Ekspanzijski blok na 72°C.
Primjena PCR-a u mikrofluidici.Shematski prikaz dirRT-qPCR na mikrofluidnoj platformi (prilagođeno iz [60]).b Shematski prikaz PCR mikropostroja kontinuiranog protoka koji se temelji na serpentinskom kanalu (prilagođeno iz [62]).c Shematski prikaz rotacijskog PCR genetskog analizatora koji se sastoji od mikročipa, tri grijaća bloka i koračnog motora (prilagođeno iz [63]).d Dijagram termokonvekcijske PCR s centrifugiranjem i postavljanjem (prilagođeno iz [64]).DirRT-qPCR, lančana reakcija polimeraze izravne kvantitativne reverzne transkripcije
Koristeći kapilare i petlje ili čak tanke ploče, konvekcijski PCR može brzo pojačati nukleinske kiseline prirodnom slobodnom toplinskom konvekcijom bez potrebe za vanjskom pumpom.Na primjer, mikrofluidna platforma cikličkog olefinskog polimera razvijena je na proizvedenom rotirajućem stupnju za zagrijavanje koji koristi toplinski ciklus s centrifugiranjem u mikrokanalu PCR petlje [64] (Slika 3d).Reakcijsku otopinu pokreće toplinska konvekcija, koja kontinuirano izmjenjuje visoku i nisku temperaturu u mikrokanalu s prstenastom strukturom.Cijeli proces amplifikacije može se dovršiti za 10 minuta s granicom detekcije od 70,5 pg/kanalu.
Kao što se i očekivalo, brzi PCR moćan je alat za potpuno integrirane sustave molekularne dijagnostike i multipleksne analize odgovora uzorka.Brzi PCR značajno skraćuje vrijeme potrebno za otkrivanje SARS-CoV-2, što doprinosi učinkovitoj kontroli pandemije COVID-19.
PCR zahtijeva složen termalni cikler koji nije prikladan za POCT.U novije vrijeme, tehnike izotermne amplifikacije primijenjene su na mikrofluidiku, uključujući, ali ne ograničavajući se na LAMP, rekombinazno polimerazno pojačanje (RPA) i pojačanje temeljeno na sekvencama nukleinskih kiselina [65,66,67,68].Ovim se tehnikama nukleinske kiseline umnožavaju na konstantnoj temperaturi, olakšavajući stvaranje jeftinih, visokoosjetljivih prijenosnih POCT uređaja za molekularnu dijagnostiku.
Visokoučinkoviti LAMP testovi temeljeni na mikrofluidici omogućuju višestruko otkrivanje zaraznih bolesti [42, 69, 70, 71].U kombinaciji s centrifugalnim mikrofluidnim sustavom, LAMP može dodatno olakšati automatizaciju detekcije nukleinske kiseline [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip razvijen je za vizualnu detekciju više paralelnih bakterija pomoću LAMP-a [76] (Sl. 4a).Kada se koristi optimizirani LAMP u testu, omjer fluorescentnog signala i šuma bio je približno 5 puta veći, a granica detekcije dosegla je 7,2 kopije/μl genomske DNA. Štoviše, postojanje pet uobičajenih probavnih bakterijskih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je na temelju metode u < 60 minuta. Štoviše, postojanje pet uobičajenih probavnih bakterijskih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je na temelju metode u < 60 minuta.Štoviše, prisutnost pet uobičajenih bakterijskih patogena probavnog trakta, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirana je ovom metodom u manje od 60 minuta.， ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 常见 细菌病 的 存在 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 菌 、 河流 弧菌 和 弧菌。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 常见 消化道 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 性 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 菌 、 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 、 、 弧菌 弧菌 弧菌 、 HIP, HIPUz to, prisutnost pet uobičajenih bakterijskih gastrointestinalnih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirana je ovom metodom u manje od 60 minuta.
Prednosti LAMP-a u mikrofluidici uključuju, između ostalog, brzi odgovor i minijaturiziranu detekciju.Međutim, zbog temperature reakcije (oko 70°C), aerosoli se neizbježno stvaraju tijekom LAMP-a, što rezultira visokom stopom lažno pozitivnih rezultata.Specifičnost testa, dizajn primera i kontrola temperature također moraju biti optimizirani za LAMP.Osim toga, dizajn čipova koji implementira višestruko otkrivanje ciljeva na jednom čipu je od velike vrijednosti i treba ga razvijati.Osim toga, LAMP je pogodan za višenamjensku detekciju integriranu u jedan čip, što je od velike važnosti, ali ima još puno prostora za razvoj.
Visoka lažno pozitivna stopa LAMP-a može se djelomično smanjiti s RPA, jer relativno niska temperatura reakcije (~37 °C) rezultira relativno malim problemima isparavanja [77].U RPA sustavu, dva suprotna početnica pokreću sintezu DNA vezanjem na rekombinazu i amplifikacija može biti dovršena unutar 10 minuta [78,79,80,81].Stoga je cijeli RPA proces puno brži od PCR-a ili LAMP-a.Posljednjih godina pokazalo se da mikrofluidna tehnologija dodatno poboljšava brzinu i točnost RPA [82,83,84].Na primjer, Liu et al.[85] razvili su mikrofluidni integrirani test amplifikacije polimeraze rekombinaze lateralnog protoka za brzo i osjetljivo otkrivanje SARS-CoV-2 integracijom RPA (RT-RPA) obrnute transkripcije i univerzalnog sustava za detekciju test traka lateralnog protoka.u jedan mikrofluidni sustav.Slika 4b).Granica detekcije je 1 kopija/µl ili 30 kopija/uzorak, a detekcija se može završiti za oko 30 minuta.Kong i sur.razvili su nosivi mikrofluidni uređaj.[86] koristili su tjelesnu temperaturu i sustav detekcije fluorescencije na mobilnom telefonu za brzo i izravno otkrivanje DNK HIV-1 pomoću RPA (Slika 4c).Nosivi RPA test detektira 100 kopija/mL ciljne sekvence unutar 24 minute, pokazujući veliki potencijal za brzu dijagnozu novorođenčadi zaražene HIV-1 u okruženjima s ograničenim resursima.
Izotermno pojačanje u ispitivanju na mjestu liječenja (POCT).Razvoj i proizvodnja spin i reakcijskog SlipChipa.Nakon plazma zavarivanja, gornji i donji čipovi su sastavljeni sa setom matica kako bi se formirao konačni čip (prilagođeno iz [76]).b Shema MI-IF-RPA sustava za otkrivanje COVID-19 (prilagođeno iz [85]).c Shema nosivog RPA testa za brzo otkrivanje DNA HIV-1 (prilagođeno iz [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluorescein, virus humane imunodeficijencije HIV, RPA rekombinaza pojačanje polimeraze, LED svjetleća dioda, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Pojačanje
RPA na bazi mikrofluida brzo se razvija, međutim, troškovi proizvodnje čipova i potrošnje reakcija su previsoki i moraju se smanjiti kako bi se povećala dostupnost ove tehnologije.Osim toga, visoka osjetljivost RPA može utjecati na pojačanje nespecifičnih proizvoda, posebno u prisutnosti kontaminacije.Ova ograničenja mogu utjecati na primjenu RPA u mikrofluidnim sustavima i zaslužuju daljnju optimizaciju.Također su potrebni dobro dizajnirani primeri i sonde za različite mete kako bi se poboljšala izvedivost mikrofluidnih strategija temeljenih na RPA u POCT.
Cas13 i Cas12a imaju sposobnost nasumičnog cijepanja nukleinskih kiselina i stoga se mogu razviti kao alati za otkrivanje i dijagnostiku.Cas13 i Cas12a se aktiviraju nakon vezanja na ciljnu DNA, odnosno RNA.Jednom aktiviran, protein počinje cijepati druge obližnje nukleinske kiseline, nakon čega vodeće RNA koje ciljaju nukleinske kiseline specifične za patogene mogu cijepati ugašene fluorescentne sonde i osloboditi fluorescenciju.Na temelju ove teorije Kellner et al.[87] razvili su metodu temeljenu na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], a Broughton et al.[88] razvili su još jedan pristup temeljen na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
Posljednjih godina pojavile su se različite metode za detekciju nukleinskih kiselina temeljene na CRISPR-u [89, 90].Konvencionalne metode temeljene na CRISPR-u često su dugotrajne i radno intenzivne zbog višestrukih postupaka uključujući ekstrakciju nukleinske kiseline, umnožavanje i CRISPR detekciju.Izlaganje tekućina zraku može povećati mogućnost lažno pozitivnih rezultata.S obzirom na gore navedeno, sustavima temeljenim na CRISPR-u prijeko je potrebna optimizacija.
Za aplikacije detekcije CRISPR-Cas12a i CRISPR-Cas13a razvijena je pneumatski kontrolirana mikrofluidna platforma koja može izvoditi 24 analize paralelno [91].Sustav je opremljen uređajem za detekciju fluorescencije koji zaobilazi pojačanje nukleinske kiseline i automatski otkriva femtomolarne DNA i RNA uzorke.Chen i sur.[92] integrirano pojačanje rekombinaze sa sustavom CRISPR-Cas12a u centrifugalnoj mikrofluidici (slika 5a).Ovim radom prevladavaju se poteškoće integracije ova dva procesa jer Cas12a može probaviti DNK glasnika i inhibirati proces amplifikacije.Osim toga, Chen i sur.[92] dodatno su prethodno pohranili reakcijske reagense u centrifugalnu mikrofluidnu kontrolu kako bi automatski dovršili cijeli proces.U drugom radu, Silva et al.[93] razvili su dijagnostičku metodu bez pojačanja CRISPR/Cas12a i pametni telefon za otkrivanje SARS-CoV-2 (Slika 5b).Ovaj test, poznat kao sustav bez amplifikacije koji se temelji na mobitelu, uključuje enzim ovisan o CRISPR/Cas koji se temelji na vizualizaciji signala mjehurića katalaze generiranih u mikrofluidnim kanalima putem pametnog telefona.Osjetljivo otkrivanje manje od 50 kopija/µl nukleinske kiseline bez prethodnog pojačanja, cijeli proces od ubrizgavanja uzorka do očitavanja signala traje samo 71 minutu.
Metode detekcije nukleinske kiseline temeljene na CRISPR-u.Centrifugalni POCT za integriranu molekularnu dijagnostiku temeljenu na CRISPR-u (prilagođeno iz [92]).b Razvoj CASCADE testa za analizu SARS-CoV-2 temeljenu na pametnim telefonima (prilagođeno iz [93]).Amplifikacija rekombinaze RAA, PAM susjedni protospacer motiv, CRISPR klasterirana kratka palindromska ponavljanja u redovitim intervalima, CASCADE sustav bez amplifikacije mobitela s enzimima ovisnim o CRISPR/CAS, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidroklorid EDC
Kao posljednji korak u detekciji nukleinske kiseline, detekcija signala izravno odražava dijagnostičke rezultate i kritičan je čimbenik u razvoju učinkovitog, osjetljivog i preciznog POCT-a.Signali se mogu očitati pomoću različitih metoda kao što su fluorescentne, elektrokemijske, kolorimetrijske i magnetske strategije.U ovom odjeljku opisujemo razloge za svaki pristup i uspoređujemo molekularnu dijagnostiku zaraznih bolesti u mikrofluidici.
Strategije temeljene na fluorescenciji naširoko se koriste za POCT dijagnostiku zaraznih bolesti zbog svojih izvanrednih prednosti izvrsne osjetljivosti, niske cijene, jednostavnosti rada i analize na mjestu liječenja [94, 95].Ove strategije koriste označene fluorofore kao što su fluorescentne boje i nanomaterijali za stvaranje detektabilnog signala (pojačanje ili gašenje fluorescencije).Ovo otkriće sugerira da se strategije temeljene na fluorescenciji mogu podijeliti na izravno fluorescentno označavanje, fluorescentno otkrivanje uključenog i isključenog signala [96].Izravno otkrivanje fluorescentnih oznaka koristi posebne fluorescentne oznake za označavanje specifičnih liganda koji generiraju određenu količinu fluorescencije kada se selektivno vežu za cilj.Za detekciju fluorescencije temeljenu na signalu, kvaliteta fluorescentnog signala pozitivno je povezana s magnitudom od interesa.Intenzitet fluorescencije je zanemariv u odsutnosti mete i može se otkriti kada je prisutna dovoljna količina mete.Nasuprot tome, intenzitet fluorescencije detektiran fluorescencijom "isključenog signala" obrnuto je proporcionalan količini mete, u početku doseže maksimalnu vrijednost i postupno se smanjuje kako se meta povećava.Na primjer, korištenjem mehanizma trans-cijepanja ovisnog o cilju CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] razvili su novu strategiju prepoznavanja za otkrivanje RNA koje izravno zaobilaze reverznu transkripciju (slika 6a).Nakon vezanja na komplementarne ciljne RNA, kompleks CRISPR-Cas13-RNA može se aktivirati, pokrećući transkolateralno cijepanje nespecifičnim reporterskim RNA.Fluorescentno obilježeni reporter [fluorofor (F)] gasi se gasiteljom (Q) netaknut i fluorescira kada ga cijepa aktivirani kompleks.
Prednost elektrokemijske detekcije je velika brzina detekcije, laka proizvodnja, niska cijena, lako nošenje i automatska kontrola.To je moćna analitička metoda za POCT aplikacije.Na temelju grafenskih tranzistora s efektom polja Gao et al.[98] razvili su nanobiosenzor za multipleksnu detekciju antigena lajmske bolesti iz bakterije Borrelia burgdorferi s granicom detekcije od 2 pg/mL (slika 6b).
Kolorimetrijski testovi korišteni su u POCT aplikacijama, iskorištavajući prednosti prenosivosti, niske cijene, jednostavnosti pripreme i vizualnog očitavanja.Kolorimetrijska detekcija može koristiti oksidaciju peroksidaze ili nanomaterijala sličnih peroksidazi, agregaciju nanomaterijala i dodavanje indikatorskih boja za pretvaranje informacija o prisutnosti ciljnih nukleinskih kiselina u vidljive promjene boje [99, 100, 101].Značajno je da se nanočestice zlata naširoko koriste u razvoju kolorimetrijskih strategija, a zbog njihove sposobnosti da induciraju brze i značajne promjene boje, sve je veći interes za razvoj POCT kolorimetrijskih platformi za in situ dijagnostiku zaraznih bolesti [102].S integriranim centrifugalnim mikrofluidnim uređajem [103], patogeni iz hrane u kontaminiranim uzorcima mlijeka mogu se automatski detektirati na razini 10 bakterijskih stanica, a rezultati se mogu očitati vizualno unutar 65 minuta (slika 6c).
Tehnike magnetskog očitavanja mogu točno detektirati analite pomoću magnetskih materijala, a posljednjih desetljeća postoji značajan interes za POCT primjenu.Tehnike magnetskog senzora imaju neke jedinstvene prednosti kao što su jeftini magnetski materijali umjesto skupih optičkih komponenti.Međutim, korištenje magnetskog polja poboljšava učinkovitost detekcije i smanjuje vrijeme pripreme uzorka [104].Osim toga, rezultati magnetskog sondiranja pokazuju visoku specifičnost, osjetljivost i visok omjer signala i šuma zbog beznačajnog magnetskog pozadinskog signala bioloških uzoraka [105].Sharma i sur.integrirao biosenzor temeljen na magnetskom tunelskom spoju u prijenosnu platformu mikročipa.[106] za multipleksnu detekciju patogena (Slika 6d).Biosenzori osjetljivo otkrivaju subnanomolarne nukleinske kiseline izolirane iz patogena.
Tipična metoda detekcije signala.Koncept hiperlokalizirane detekcije Cas13a (prilagođeno iz [97]).b Grafenski nanobiosenzor FET u kombinaciji s Lyme GroES scFv (prilagođeno iz [98]).c Kolorimetrijske indikacije za višestruku detekciju patogena koji se prenose hranom u centrifugalnom mikrofluidnom čipu: uzorci br. 1 i br. 3 s ciljanim patogenima i uzorci br. 2, br. 4 i br. 5 bez ciljanih patogena (prilagođeno iz [103]) .d Biosenzor temeljen na magnetskom tunelskom spoju, uključujući platformu, ugrađeno pojačalo za blokiranje, kontrolnu jedinicu i napajanje za generiranje/prikupljanje signala (prilagođeno iz [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikon, PMMA polimetil metakrilat
Unatoč izvrsnim karakteristikama gore navedenih metoda detekcije, one još uvijek imaju nedostatke.Ove metode se uspoređuju (tablica 1), uključujući neke aplikacije s detaljima (za i protiv).
S razvojem mikrofluidike, mikroelektromehaničkih sustava, nanotehnologije i znanosti o materijalima, uporaba mikrofluidnih čipova za detekciju zaraznih bolesti stalno napreduje [55,96,107,108].Precizna manipulacija minijaturnom opremom i tekućinama doprinosi dijagnostičkoj točnosti i isplativosti.Stoga su za daljnji razvoj uloženi napori za optimizaciju i nadogradnju čipova, što je rezultiralo različitim mikrofluidnim čipovima s različitim strukturama i funkcijama.Ovdje ukratko predstavljamo nekoliko uobičajenih tipova mikrofluidnih platformi i uspoređujemo njihove karakteristike (prednosti i mane).Osim toga, većina dolje navedenih primjera prvenstveno se fokusira na borbu protiv SARS-CoV-2.
LOCC su najčešći minijaturizirani složeni analitički sustavi i njihove operacije su vrlo minijaturizirane, integrirane, automatizirane i paralelizirane od ubrizgavanja i pripreme uzorka, kontrole protoka i detekcije tekućine [109, 110].Tekućinama se manipulira kroz pažljivo osmišljenu geometriju i interakciju mnogih fizičkih učinaka kao što su gradijenti tlaka, kapilarno djelovanje, elektrodinamika, magnetska polja i akustični valovi [111].LOCC pokazuje izvrsne prednosti u probiru visoke propusnosti i višestrukoj detekciji, s velikom brzinom analize, malom veličinom uzorka, niskom potrošnjom energije i visokom učinkovitošću upravljanja i rada;međutim, LOCC uređaji su vrlo osjetljivi, a proizvodnja, pakiranje i sučelje.Međutim, multipleksiranje i ponovna uporaba suočavaju se s ogromnim poteškoćama [96].U usporedbi s drugim platformama, LOCC ima jedinstvene prednosti u smislu maksimalne raznolikosti aplikacija i najbolje kompatibilnosti tehnologije, ali su i njegovi nedostaci očiti, naime visoka složenost i slaba ponovljivost.Ovisnost o vanjskim pumpama, koje su često glomazne i skupe, dodatno ograničava njihovu upotrebu u POCT-u.
Tijekom izbijanja COVID-19, LOCC je dobio mnogo pažnje.U isto vrijeme, postoji nekoliko novih čipova koji kombiniraju nekoliko tehnologija.Na primjer, pametni telefoni sada se široko koriste kao prijenosni analitički uređaji i imaju veliki potencijal za integraciju LOCC-a.Sun i sur.[21] proizveli su mikrofluidni čip koji omogućuje multipleksiranje specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina pet patogena, uključujući SARS-CoV-2, pomoću LAMP-a i analizirali ih pomoću pametnog telefona unutar 1 sata nakon završetka reakcije.Kao drugi primjer, Sundah et al.[112] stvorio je molekularni prekidač [katalitičko pojačanje prekidačem molekularnog prijelaznog stanja (CATCH)] za izravnu i osjetljivu detekciju meta SARS-CoV-2 RNA pomoću pametnih telefona. CATCH je kompatibilan s prijenosnim LOCC-om i postiže vrhunske performanse (približno 8 kopija RNA/μl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan s prijenosnim LOCC-om i postiže vrhunske performanse (približno 8 kopija RNA/μl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan s portativnim LOCC-om i osigurava izvanrednu produktivnost (primjerno 8 kopija RNK/mkl; < 1 h pri sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan s prijenosnim LOCC-om i pruža izvrsnu propusnost (približno 8 RNA kopija/µl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH je kompatibilan s portativnim LOCC-om i ima izvrsnu produktivnost (primjerno 8 kopija RNK/mkl; < 1 sat pri sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan s prijenosnim LOCC-ovima i ima izvrsne performanse (približno 8 kopija RNA/µl; < 1 sat na sobnoj temperaturi) [112].Osim toga, LOCC uređaji za molekularnu dijagnostiku također koriste neke pokretačke sile kao što su vakuum, istezanje i električna polja.Kang i sur.[113] demonstrirao je ultra-brzi PCR nanoplazme na čipu u stvarnom vremenu za brzu i kvantitativnu dijagnostiku COVID-19 na terenu koristeći vakuumski plazmonski tekući PCR čip.Li et al.[114] su kasnije razvili rastezljivi mikrofluidni čip koji je omogućio dijagnozu COVID-19.Platforma koristi sustav pojačanja RT-LAMP kako bi utvrdila je li uzorak kvalitativno pozitivan ili negativan.Nakon toga, Ramachandran et al.[115] postigli su odgovarajuće gradijente električnog polja korištenjem izotakoforeze (ITP), tehnike selektivnog fokusiranja iona primijenjene u mikrofluidici.Uz ITP, ciljna RNA iz sirovih uzoraka nazofaringealnog brisa može se automatski pročistiti.Zatim Ramachandran et al.[115] Kombinacijom ovog pročišćavanja ITP-a s LAMP i CRISPR testovima poboljšanim ITP-om otkriven je SARS-CoV-2 u ljudskom nazofaringealnom brisu i kliničkim uzorcima za oko 35 minuta.Osim toga, stalno se pojavljuju nove ideje.Jadhav i sur.[116] predložio je dijagnostičku shemu koja se temelji na Ramanovoj spektroskopiji s poboljšanom površinom u kombinaciji s mikrofluidnim uređajem koji sadrži okomito orijentirane ugljikove nanocijevi obložene zlatom/srebrom ili jednokratne elektrospunirane mikro/nanocijevi.Ugrađeni filtarski mikrokanali funkcionalizirani membranom su jednokratni.Uređaj adsorbira viruse iz različitih tjelesnih tekućina/izlučevina poput sline, nazofarinksa i suza.Stoga je titar virusa obilan i virus se može točno identificirati pomoću Ramanovog potpisa.
LOAD je centrifugalna mikrofluidna platforma u kojoj su svi procesi kontrolirani frekvencijskim protokolom koji rotira mikrostrukturirani supstrat [110].Uređaj LOAD karakterizira korištenje centrifugalne sile kao važne pokretačke sile.Tekućine su također podložne kapilarnim, Eulerovim i Coriolisovim silama.Pomoću uređaja za centrifugu analize se izvode u kontinuiranom radu tekućine od radijalnog položaja prema unutra prema van, eliminirajući potrebu za dodatnim vanjskim cijevima, pumpama, aktuatorima i aktivnim ventilima.Ukratko, jedna metoda upravljanja pojednostavljuje rad.Sile koje djeluju na tekućinu u istom mikrofluidnom kanalu na istoj udaljenosti od centra opterećenja su jednake, što omogućuje ponavljanje strukture kanala.Stoga je LOAD oprema jednostavnija i ekonomičnija za projektiranje i proizvodnju od konvencionalne LOCC opreme, dok su reakcije uglavnom neovisne i paralelizirane;međutim, zbog visoke mehaničke čvrstoće centrifugalne opreme, raspoloživi materijal za strugotinu je ograničen i male količine su teške.do auta.U isto vrijeme, većina LOAD uređaja je dizajnirana samo za jednokratnu upotrebu, što je skupo za detekciju velikih razmjera [96, 117, 118, 119].
Posljednjih desetljeća, LOAD, koji se smatra jednim od najperspektivnijih mikrofluidnih uređaja, dobio je značajnu pozornost istraživača i proizvođača.Stoga je LOAD stekao široku prihvaćenost i koristi se za molekularnu dijagnostiku zaraznih patogena [120, 121, 122, 123, 124], posebno tijekom izbijanja COVID-19.Na primjer, krajem 2020., Ji et al.[60] demonstrirali su izravan RT-qPCR test za brzo i automatizirano paralelno otkrivanje SARS-CoV-2 i infekcija virusom influence A i B u uzorcima brisa grla.Zatim su Xiong i sur.[74] predstavili su diskoidnu mikrofluidnu platformu integriranu u LAMP za brzu, točnu i simultanu detekciju sedam ljudskih respiratornih koronavirusa, uključujući SARS-CoV-2, unutar 40 minuta.Početkom 2021. de Oliveira et al.[73] demonstrirao je polistirenski toner centrifugalni mikrofluidni čip, kojim se ručno upravlja rotatorom vrha prsta, za RT-LAMP molekularnu dijagnostiku COVID-19.Nakon toga, Dignan et al.[39] predstavili su automatizirani prijenosni centrifugalni mikrouređaj za pročišćavanje SARS-CoV-2 RNA izravno iz dijelova bukalnog brisa.Medved i sur.[53] predložio je inline sustav uzorkovanja aerosola SARS-CoV-2 s rotirajućim mikrofluidnim fluorescentnim čipom malog volumena s granicom detekcije od 10 kopija/μL i minimalnim pragom ciklusa od 15 minuta.Suarez i sur.[75] nedavno je izvijestio o razvoju integrirane modularne centrifugalne mikrofluidne platforme za izravnu detekciju SARS-CoV-2 RNA u toplinski inaktiviranim uzorcima nazofaringealnog brisa pomoću LAMP-a.Ovi primjeri pokazuju velike prednosti i obećanja LOAD-a u molekularnoj dijagnostici COVID-19.
Godine 1945. Muller i Clegg [125] prvi su predstavili mikrofluidne kanale na papiru koristeći filter papir i parafin.Godine 2007. grupa Whitesides [126] stvorila je prvu funkcionalnu papirnatu platformu za testiranje proteina i glukoze.Papir je postao idealan supstrat za mikrofluidiku.Papir ima svojstvena svojstva kao što su hidrofilnost i porozna struktura, izvrsna biokompatibilnost, mala težina, fleksibilnost, sklopivost, niska cijena, jednostavnost upotrebe i praktičnost.Klasični µPAD-ovi sastoje se od hidrofilnih/hidrofobnih struktura izgrađenih na papirnatim podlogama.Ovisno o trodimenzionalnoj strukturi, μPAD-ovi se mogu podijeliti na dvodimenzionalne (2D) i trodimenzionalne (3D) μPAD-ove.2D µPAD-ovi se proizvode formiranjem hidrofobnih granica za formiranje mikrofluidnih kanala, dok se 3D µPAD-ovi obično izrađuju od hrpe slojeva 2D mikrofluidnog papira, ponekad savijanjem papira, tehnikama slip-a, otvorenim kanalima i 3D ispisom [96].Vodene ili biološke tekućine na μPAD primarno se kontroliraju kapilarnom silom bez vanjskog izvora napajanja, olakšavajući prethodno skladištenje reagensa, rukovanje uzorcima i multipleksnu detekciju.Međutim, točna kontrola protoka i detekcija multipleksa su ometeni nedovoljnom brzinom detekcije, osjetljivošću i mogućnošću ponovne upotrebe [96, 127, 128, 129, 130].
Kao neobična mikrofluidna platforma, μPAD je naširoko promoviran i razvijen za molekularnu dijagnostiku zaraznih bolesti kao što su HCV, HIV i SARS-CoV-2 [131, 132].Za selektivnu i osjetljivu detekciju HCV-a, Tengam i sur.[133] razvili su novi biosenzor temeljen na fluorescentnom papiru koristeći visoko specifičnu sondu nukleinske kiseline temeljenu na pirolidinil peptidu.Nukleinske kiseline su kovalentno imobilizirane na djelomično oksidiranom celuloznom papiru reduktivnom alkilacijom između amino skupina i aldehidnih skupina, a detekcija se temelji na fluorescenciji.Ove signale može očitati posebno izrađena naprava s prijenosnom fluorescentnom kamerom u kombinaciji s kamerom mobitela.Nakon toga, Lu et al.[134] dizajnirali su fleksibilnu elektrodu na bazi papira koja se temelji na nanočesticama nikla/zlata/ugljičnim nanocjevčicama/kompozitima organometalnog okvira od polivinil alkohola za detekciju cilja HIV-a hibridizacijom DNA koristeći metilensko modrilo kao redoks indikator DNA.Nedavno su Chowdury i sur.[135] predstavili su hipotetski dizajn platforme za µPAD testiranje na mjestu liječenja korištenjem sirove sline pacijenata u kombinaciji s LAMP-om i prijenosnom slikovnom tehnologijom za detekciju analita COVID-19.
Ispitivanja bočnog protoka usmjeravaju tekućine pomoću kapilarnih sila i kontroliraju kretanje tekućine pomoću sposobnosti vlaženja i karakteristika poroznih ili mikrostrukturiranih podloga.Uređaji za lateralni protok sastoje se od uzorka, konjugata, inkubatora i detekcije te upijajućih jastučića.Molekule nukleinske kiseline u LFA prepoznaju specifična veziva koja su unaprijed pohranjena na veznom mjestu i vežu se kao kompleksi.Dok tekućina prolazi kroz ploče za inkubaciju i detekciju, komplekse hvataju molekule za hvatanje koje se nalaze na testnim i kontrolnim linijama, pokazujući rezultate koji se mogu očitati izravno golim okom.Obično se LFA može dovršiti za 2-15 minuta, što je brže od tradicionalnog otkrivanja.Zbog posebnog mehanizma, LFA zahtijeva malo operacija i ne zahtijeva dodatnu opremu, što ga čini vrlo lakim za korištenje.Jednostavan je za proizvodnju i minijaturizaciju, a cijena podloga na bazi papira je niža.Međutim, koristi se samo za kvalitativnu analizu, a kvantitativna je detekcija vrlo teška, a sposobnost multipleksiranja i propusnost su vrlo ograničeni, te se može otkriti samo jedna dovoljna količina nukleinske kiseline u jednom trenutku [96,110,127].
Iako je većina primjena LFA usmjerena na imunotestove, upotreba LFA za molekularnu dijagnostiku u mikrofluidnim čipovima također je učinkovita i popularna [136].U slučaju virusa hepatitisa B, HIV-a i SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] predložio je LFA platformu nanočestica s povećanjem konverzije i pokazao svestranost ove minijaturizirane i prijenosne platforme putem osjetljive i kvantitativne detekcije višestrukih ciljeva kao što je HBV nukleinska kiselina.Osim toga, Fu et al.[138] demonstrirao je novi LFA temeljen na Ramanovoj spektroskopiji s poboljšanom površinom za kvantitativnu analizu DNA HIV-1 pri niskim koncentracijama.Za brzo i osjetljivo otkrivanje SARS-CoV-2, Liu et al.[85] razvili su mikrofluidički integriranu RPA analizu bočnog protoka kombinirajući RT-RPA i univerzalni sustav detekcije bočnog protoka u jedan mikrofluidički sustav.
Primjena različitih mikrofluidnih platformi varira ovisno o specifičnim studijama, pri čemu se u potpunosti iskorištavaju mogućnosti i prednosti platformi.S pristupačnim ventilima, pumpama i kanalima, LOCC je najopsežnija platforma za raznolikost aplikacija i interoperabilnost s najvećim prostorom za razvoj.Stoga se nadamo i preporučamo da se najnovije studije provedu u LOCC-u kao prvi pokušaj i da se uvjeti optimiziraju.Osim toga, očekuje se otkrivanje i korištenje učinkovitijih i preciznijih metoda u sustavu.LOAD se ističe preciznom kontrolom tekućina iz postojećih LOCC uređaja i pokazuje jedinstvene prednosti u pojedinačnim pogonima centrifugalnom silom bez potrebe za vanjskim pogonima, dok paralelni odgovori mogu biti odvojeni i sinkronizirani.Tako će u budućnosti LOAD postati glavna mikrofluidna platforma s manje ručnih operacija i zrelijim i automatiziranijim tehnologijama.µPAD platforma kombinira prednosti LOCC-a i materijala temeljenih na papiru za jeftinu dijagnostiku za jednokratnu upotrebu.Stoga bi se budući razvoj trebao usredotočiti na prikladne i dobro uhodane tehnologije.Osim toga, LFA je vrlo prikladan za detekciju golim okom, obećavajući smanjenje potrošnje uzoraka i ubrzanje detekcije.Detaljna usporedba platformi prikazana je u tablici 2.
Digitalne analize dijele uzorak u mnogo mikroreaktora, od kojih svaki sadrži diskretan broj ciljnih molekula [139, 140].Digitalni testovi nude značajne prednosti za izvođenje apsolutne kvantifikacije izvođenjem tisuća paralelnih biokemijskih eksperimenata istovremeno i pojedinačno u odjeljcima mikronske skale umjesto u kontinuiranoj fazi.U usporedbi s tradicionalnom mikrofluidikom, reakcije odjeljka mogu smanjiti volumen uzorka, povećati učinkovitost reakcije i lako se integrirati s drugim analitičkim metodama bez potrebe za kanalima, pumpama, ventilima i kompaktnim dizajnom [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Sljedeće dvije metode koriste se u digitalnim testovima za postizanje ujednačenog i preciznog odvajanja otopina, uključujući reagense i uzorke kao što su stanice, nukleinske kiseline i druge čestice ili molekule: (1) emulzije u obliku kapi koje iskorištavaju nestabilnost sučelja tekućine;(2) podjela niza provodi se geometrijskim ograničenjima uređaja.U prvoj metodi, kapljice koje sadrže reagense i uzorke u mikrokanalima mogu se stvoriti pasivnim metodama kao što su istostrujni, poprečni protok, fokusiranje protoka, postupna emulgacija, mikrokanalna emulgacija i membrane putem viskoznih sila smicanja i emulgiranje s promjenom kanala.lokalizacijom [143, 145, 146, 148, 149] ili korištenjem aktivnih metoda [150, 151], koje uvode dodatnu energiju putem električne, magnetske, toplinske i mehaničke kontrole.U potonjem pristupu, najbolja ujednačenost volumena tekućine u mikrofluidnim komorama dijeli se zadržavanjem prostornih struktura iste veličine, poput mikrojama i površinskih nizova [152,153,154].Značajno, kapljice su glavni dijelovi protoka koji se također mogu generirati i manipulirati na nizovima elektroda na temelju digitalne mikrofluidike (DMF).Elektrokvašenje dielektrika jedna je od najbolje proučavanih teorija DMF-a, budući da elektromočenje dielektrika omogućuje preciznu manipulaciju pojedinačnim kapljicama, kontroliranje oblika tekućine i asimetričnih električnih signala koji prolaze različitim stranama [141, 144].Glavne operacije s kapljicama u DMF-u uključuju razvrstavanje, cijepanje i spajanje [151, 155, 156], koje se mogu primijeniti u raznim područjima analize, posebice u molekularnoj detekciji [157, 158, 159].
Digitalna detekcija nukleinske kiseline treća je generacija molekularne dijagnostičke tehnologije koja slijedi nakon konvencionalne PCR i kvantitativne PCR u stvarnom vremenu (qPCR), paralelno s visokopropusnim sekvenciranjem i tekućom biopsijom.U posljednja dva desetljeća digitalne nukleinske kiseline su se brzo razvile u području molekularne dijagnostike infektivnih patogena [160, 161, 162].Apsolutna kvantifikacija digitalne detekcije nukleinske kiseline počinje pakiranjem uzoraka i reagensa u pojedinačne odjeljke kako bi se osiguralo da svaka ciljna sekvenca ima istu vjerojatnost ulaska u svaki pojedinačni odjeljak.Teoretski, svakoj sekciji može biti dodijeljeno više ciljnih sekvenci ili možda ne postoji neovisni mikroreakcijski sustav.Kroz različite senzorske mehanizme opisane gore, odjeljci s ciljnim sekvencama mikroba koje generiraju signale iznad određenog praga mogu se vizualizirati golim okom ili strojem i označeni su kao pozitivni, dok su drugi odjeljci koji generiraju signale ispod praga označeni kao pozitivni .negativne, što signal za svaki odjeljak čini booleovim.Stoga, izračunavanjem broja stvorenih odjeljaka i stope pozitivnih rezultata nakon reakcije, izvorne kopije ispitnih uzoraka mogu se usporediti pomoću formule Poissonove distribucije bez potrebe za standardnom krivuljom, koja je potrebna za rutinske kvantitativne analize kao što su kao qPCR.[163] U usporedbi s tradicionalnim metodama molekularne dijagnostike, digitalna detekcija nukleinske kiseline ima viši stupanj automatizacije, veću brzinu analize i osjetljivost, manje reagensa, manje kontaminacije te jednostavniji dizajn i proizvodnju.Iz tih razloga, korištenje digitalnih analiza, posebno metoda koje se temelje na kapi, za molekularnu dijagnostiku, kombinirajući tehnike pojačanja i očitavanja signala, dobro je proučeno tijekom kritične epidemije SARS-CoV-2.Na primjer, Yin i sur.[164] kombinirane digitalne kapljične i brze PCR metode za otkrivanje gena ORF1ab, N i RNase P u SARS-CoV-2 u mikrofluidnom čipu.Naime, sustav je uspio identificirati pozitivan signal unutar 115 sekundi, što je brže od konvencionalnog PCR-a, što ukazuje na njegovu učinkovitost u otkrivanju na mjestu skrbi (Slika 7a).Dong i sur.[165], Sow i sur.[157], Chen i sur.[166] i Alteri et al.[167] također su primijenili digitalni PCR kapljicama (ddPCR) za otkrivanje SARS-CoV-2 u mikrofluidnom sustavu s impresivnim rezultatima.Kako bi dodatno poboljšali stopu otkrivanja, Shen et al.[168] postigli su oslikavanje čipa temeljeno na ddPCR-u za samo 15 s bez upotrebe tehnika spajanja slika, ubrzavajući proces tehnologije ddPCR od laboratorija do primjene.Ne primjenjuju se samo metode toplinske amplifikacije kao što je PCR, već se koriste i metode izotermne amplifikacije za pojednostavljenje uvjeta reakcije i brz odgovor.Lu i sur.[71] razvili su SlipChip za analizu kapljica, sposoban za generiranje kapljica različitih veličina visoke gustoće u jednom koraku i kvantificiranje nukleinskih kiselina SARS-CoV-2 pomoću digitalnog LAMP-a (Slika 7b).Kao tehnologija koja se brzo razvija, CRISPR također može igrati važnu ulogu u digitalnoj detekciji nukleinske kiseline putem praktičnog kolorimetrijskog snimanja bez potrebe za dodatnim bojama nukleinske kiseline.Ackerman i sur.razvio kombinatornu matričnu reakciju za multipleksnu procjenu nukleinskih kiselina.[158] otkrili su 169 virusa povezanih s ljudima, uključujući SARS-CoV-2, u kapljicama koje sadrže reagense za detekciju nukleinske kiseline temeljene na CRISPR-Cas13 u testu mikrojažica (Slika 7c).Osim toga, izotermno pojačanje i CRISPR tehnologija mogu se koristiti u istom sustavu kako bi se kombinirale prednosti oba.Park i sur.[169] Digitalni test CRISPR/Cas12a razvijen je u komercijalnom mikrofluidnom čipu za detekciju ekstrahiranog i toplinski ubijenog SARS-CoV-2 na temelju jednostupanjskog RT-RPA s kraćim i višim signalom u pozadini detekcije omjer vremena., širi dinamički raspon i bolja osjetljivost (slika 7d).Neki opisi ovih primjera dati su u tablici 3.
Tipična digitalna platforma za detekciju nukleinskih kiselina.a Brzi digitalni PCR radni tijek sastoji se od četiri ključna koraka: priprema uzorka, distribucija reakcijske smjese, proces amplifikacije i kvantifikacija cilja (prilagođeno iz [164]).b Shematski prikaz analize SlipChip kapljica za stvaranje kapljica pri visokoj gustoći (prilagođeno iz [71]).c CARMEN-Cas dijagram tijeka rada13 (prilagođeno iz [158]).d Pregled napredne digitalne detekcije virusa s CRISPR/Cas u jednoj posudi (prilagođeno iz [169]).W/O voda u ulju, polidimetilsiloksan PDMS, PCR lančana reakcija polimeraze, DAQ prikupljanje podataka, PID proporcionalni integralni derivat, CARMEN reakcija kombinatorne matrice za procjenu multiple nukleinske kiseline, SARS-CoV-2, teški akutni respiratorni sindrom, koronavirus 2, RT Amplifikacija reverzne transkriptaze rekombinaze polimeraze-RPA, S/B signal u pozadini