Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Enzimske metode označavanja blizine temeljene na aktiviranim esterima ili fenoksi radikalima naširoko se koriste za mapiranje substaničnih proteoma i proteinskih interaktora u živim stanicama.Međutim, aktivirani esteri su manje reaktivni, što rezultira širokim radijusom označavanja, a fenoksi radikali generirani tretmanom peroksidom mogu ometati redoks puteve.Ovdje izvješćujemo o metodi fotoaktivacije ovisne o označavanju blizine (PDPL) koja je razvijena genetskim povezivanjem proteina fotosenzibilizatora miniSOG s proteinom od interesa.Pokrenut plavim svjetlom i kontroliran vremenom izlaganja, generira se singletni kisik, a zatim se postiže prostorno-vremensko razlučeno označavanje histidinskih ostataka anilinskom sondom.Njegovu visoku vjernost demonstriramo mapiranjem proteoma specifičnim za organele.Usporedna usporedba PDPL-a s TurboID-om pokazuje specifičniju i sveobuhvatniju proteomsku pokrivenost PDPL-a.Zatim smo primijenili PDPL na transkripcijski koaktivator BRD4 i E3 Parkin ligazu povezan s bolešću i pronašli prethodno nepoznate interaktere.Probirom prekomjerne ekspresije, dva nepoznata supstrata, Ssu72 i SNW1, identificirana su za Parkin, čija je razgradnja posredovana putem ubikvitinacije-proteasoma.
Točna karakterizacija proteinskih mreža je temelj mnogih temeljnih staničnih procesa.Stoga će vrlo precizno prostorno-vremeno mapiranje interakcija proteina pružiti molekularnu osnovu za dešifriranje bioloških putova, patologije bolesti i prekidanje tih interakcija u terapeutske svrhe.U tu svrhu vrlo su poželjne metode koje mogu detektirati vremenske interakcije u živim stanicama ili tkivima.Masena spektrometrija afinitetnog pročišćavanja (AP-MS) povijesno se koristila za identifikaciju partnera vezanja proteina od interesa (POI).Razvojem metoda kvantitativne proteomike nastao je Bioplex3.0, najveća baza proteinskih mreža temeljena na AP-MS.Iako je AP-MS vrlo moćan, koraci lize i razrjeđivanja stanica u tijeku rada usmjereni su prema slabim i prolaznim interakcijama vezanja i uvode artefakte nakon lize, kao što su lažni parovi interakcija kojima nedostaje kompartmentalizacija prije lize.
Kako bi se riješili ti problemi, razvijene su neprirodne aminokiseline (UAA) sa skupinama za umrežavanje i enzimske platforme za označavanje u blizini (PL) (npr. APEX i BioID)5.Iako je UAA metoda uspješno primijenjena u mnogim scenarijima i pruža informacije o izravnim proteinskim ljepilima, još uvijek je potrebna optimizacija mjesta umetanja UAA.Što je još važnije, to je stehiometrijska metoda označavanja kojoj nedostaje katalitičko preokretanje događaja označavanja.Nasuprot tome, enzimske PL metode, kao što je BioID metoda, stapaju projektiranu biotin ligazu u POI7, koji zatim aktivira biotin da formira reaktivni biotinil-AMP ester intermedijer.Enzim tako katalizira i oslobađa aktivirani biotinski "oblak" koji označava proksimalne ostatke lizina.Međutim, BioID-u je potrebno više od 12 sati za dobivanje dovoljno označenog signala, što isključuje njegovu upotrebu s vremenskom rezolucijom.Koristeći usmjerenu evoluciju temeljenu na prikazu kvasca, TurboID je dizajniran na temelju BioID-a kako bi bio učinkovitiji, omogućujući učinkovito označavanje biotinom unutar 10 minuta, omogućujući proučavanje dinamičnijih procesa.Budući da je TurboID vrlo aktivan i da su endogene razine biotina dovoljne za označavanje niske razine, pozadinsko označavanje postaje potencijalni problem kada je potrebno visoko poboljšano i vremensko označavanje dodavanjem egzogenog biotina.Osim toga, aktivirani esteri su slabo reaktivni (t1/2 ~5 min), što može dovesti do velikog radijusa označavanja, posebno nakon zasićenja susjednih proteina biotinom 5. U drugom pristupu, genetska fuzija modificirane askorbat peroksidaze (tj. biotin- fenolne radikale i omogućuje označavanje proteina unutar jedne minute 9, 10. APEX se široko koristi za identifikaciju subcelularnih proteoma, membranskih proteinskih kompleksa i citosolnih signalnih proteinskih kompleksa 11, 12. Međutim, potreba za visokim koncentracijama peroksida može utjecati na redoks proteine ili putove, ometajući stanični procesi.
Stoga će nova metoda sposobna generirati reaktivnije vrste za suzbijanje označenog radijusa s visokom prostornom i vremenskom točnošću bez značajnog ometanja staničnih putova biti važan dodatak postojećim metodama. Među reaktivnim vrstama, singletni kisik je izazvao našu pozornost zbog svog kratkog vijeka trajanja i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u stanicama)13. Među reaktivnim vrstama, singletni kisik je izazvao našu pozornost zbog svog kratkog vijeka trajanja i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u stanicama)13. Među aktivnim formama naše pozornosti privučen je singletni kislor iz njegovog kratkog vremena života i ograničenog polumjera difuzije (t1/2 < 0,6 mks u kletkama)13. Među aktivnim oblicima, singletni kisik privukao je našu pozornost zbog svog kratkog vijeka trajanja i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u stanicama)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Srednje aktivne forme naše pozornosti privlače singletni kisik iz njegovog kratkog vremena života i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 mks u kletkama). Među aktivnim oblicima, singletni kisik privlači našu pozornost zbog svog kratkog vijeka trajanja i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 μs u stanicama).Zabilježeno je da singletni kisik nasumično oksidira metionin, tirozin, histidin i triptofan, čineći ga polarnim 14,15 za vezanje na sonde temeljene na aminu ili tiolu16,17.Iako je singlet kisik korišten za označavanje RNA subcelularnog odjeljka, strategije za prenamjenu endogenih markera blizine POI ostaju neistražene.Ovdje predstavljamo platformu koja se zove označavanje blizine ovisno o fotoaktivaciji (PDPL), gdje koristimo plavo svjetlo za osvjetljavanje točaka interesa spojenih s miniSOG fotosenzibilizatorom i pokreću generiranje singletnog kisika za oksidaciju proksimalnih ostataka, nakon čega slijede modifikacije koje sadrže amine za oksidaciju kemijskih sondi u srednje žive stanice..Testirali smo skupinu kemijskih sondi kako bismo povećali specifičnost oznake i identificirali mjesta modifikacije pomoću otvorenog tijeka rada proteomike.Usporedna usporedba PDPL-a s TurboID-om pokazuje specifičniju i sveobuhvatniju proteomsku pokrivenost PDPL-a.Primijenili smo ovaj pristup na markere specifične za organele subcelularnog proteoma i opću identifikaciju proteoma vezanih partnera za epigenetski regulatorni protein BRD4 povezan s rakom i E3 ligazu Parkin povezanu s Parkinsonovom bolešću, što je potvrdilo i poznatu i nepoznatu mrežu proteina interakcije..Sposobnost PDPL da prepozna supstrate E3 u velikim proteinskim kompleksima predstavlja situaciju u kojoj je potrebno prepoznavanje neizravnih veziva.Dva nepoznata supstrata parkina posredovana ubikvitinacijskim proteasomom potvrđena su in situ.
Fotodinamička terapija (PDT)19 i laserska inaktivacija potpomognuta kromoforom (CALI)20, u kojoj svjetlosno zračenje s fotosenzibilizatorima stvara singletni kisik, može inaktivirati ciljne proteine ili uzrokovati smrt stanice.Budući da je singletni kisik vrlo reaktivna tvar s teoretskom udaljenošću difuzije od oko 70 nm, može se kontrolirati prostorno ograničena oksidacija oko fotosenzibilizatora.Na temelju ovog koncepta odlučili smo upotrijebiti singletni kisik kako bismo postigli blisko označavanje proteinskih kompleksa u živim stanicama.Razvili smo kemoproteomski pristup PDPL koji ispunjava četiri funkcije: (1) katalizirati stvaranje aktivnog singletnog kisika slično PL enzimskom pristupu;(2) osigurati vremenski razlučno označavanje nakon pokretanja svjetlom;(3) alteracijom (4) Izbjegavajte korištenje endogenih kofaktora (kao što je biotin) za smanjenje pozadine ili koristite vrlo uznemirujuće egzogene reagense (kao što su peroksidi) kako biste smanjili izloženost stanica stresu iz okoliša.
Fotosenzibilizatori se mogu podijeliti u dvije kategorije uključujući fluorofore male molekularne težine (npr. bengalska ruža, metilensko plavo)22 i genetski kodirane male proteine (npr. miniSOG, KillerRed)23.Kako bismo postigli modularni dizajn, razvili smo prvu generaciju PDPL platforme dodavanjem proteina fotosenzibilizatora (PS) u POI24,25 (Slika 1a).Kada je ozračen plavim svjetlom, singletni kisik oksidira proksimalne nukleofilne aminokiselinske ostatke, što rezultira umpolung polaritetom koji je elektrofilan i može dalje reagirati s nukleofilima aminske sonde16,17.Sonda je dizajnirana s alkinskom ručkom koja omogućuje kemiju klikova i povlačenje prema dolje za LC/MS/MS karakterizaciju.
Shematski prikaz označavanja proteinskih kompleksa posredovanih miniSOG.Kada su izložene plavom svjetlu, stanice koje eksprimiraju miniSOG-POI stvaraju singletni kisik, koji modificira proteine u interakciji, ali ne i proteine koji se ne vežu.Međuprodukte fotooksidacije presreću relejne oznake kemijske sonde za amin da bi se formirali kovalentni adukti.Alkinilna skupina na kemijskoj sondi omogućuje kemiju klika za obogaćivanje povlačenjem nakon čega slijedi LC-MS/MS kvantifikacija.b Kemijska struktura aminskih sondi 1-4.c Reprezentativna fluorescentna gel analiza mitohondrijskih lokaliziranih proteomskih markera posredovanih miniSOG-om korištenjem sondi 1-4 i relativne kvantifikacije temeljene na gel denzitometriji.Omjer signala i pozadine kemijskih proba procijenjen je korištenjem eksperimenata negativne kontrole isključujući plavo svjetlo ili korištenjem HEK293T stanica bez ekspresije miniSOG.n = 2 biološki neovisna uzorka.Svaka točka predstavlja biološku repliku.d Reprezentativno otkrivanje i kvantifikacija PDPL-a pomoću optimizirane sonde 3 u prisutnosti ili odsutnosti naznačenih komponenti PDPL-a kao što je c.n = 3 biološki neovisna uzorka.Svaka točka predstavlja biološku repliku.Središnje linije i brkovi predstavljaju srednju vrijednost i ± standardnu devijaciju.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokalna slika singletnog kisika s dalekocrvenom Si-DMA mrljom.Mjerna traka: 10 µm.Oslikavanje gelom i konfokalni eksperimenti neovisno su ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.
Prvo smo testirali sposobnost zrelih fotosenzibilizatora miniSOG26 i KillerRed23, stabilno eksprimiranih u HEK293T, da posreduju u obilježavanju propargilamina proteoma kao kemijske sonde (dodatna slika 1a).Analiza fluorescencije gela pokazala je da je obilježavanje cijelog proteoma postignuto pomoću miniSOG i zračenja plavim svjetlom, dok nije primijećen vidljiv proizvod označavanja s KillerRed.Kako bismo poboljšali omjer signala i pozadine, zatim smo testirali skup kemijskih sondi koje sadrže anilin (1 i 3), propilamin (2) ili benzilamin (4).Uočili smo da same stanice HEK293T imaju viši pozadinski signal u usporedbi s odsutnošću plavog svjetla, vjerojatno zbog endogenog fotosenzibilizatora riboflavina, flavin mononukleotida (FMN) 27 . Kemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina dale su bolju specifičnost, pri čemu HEK293T stabilno eksprimira miniSOG u mitohondrijima pokazujući >8 puta veći signal za sondu 3, dok je sonda 2 korištena u metodi označavanja RNA CAP-seq prikazala samo ~2,5- višestruko povećanje signala, vjerojatno zbog različitih preferencija reaktivnosti između RNA i proteina (Slika 1b, c). Kemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina dale su bolju specifičnost, pri čemu HEK293T stabilno eksprimira miniSOG u mitohondrijima pokazujući >8 puta veći signal za sondu 3, dok je sonda 2 korištena u metodi označavanja RNA CAP-seq prikazala samo ~2,5- višestruko povećanje signala, vjerojatno zbog različitih preferencija reaktivnosti između RNA i proteina (Slika 1b, c).Kemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina pokazale su bolju specifičnost: HEK293T, koji stabilno izražava miniSOG u mitohondrijima, pokazuje više od 8 puta povećanje signala za sondu 3, dok je sonda 2, korištena u metodi označavanja CAP-seq RNA, samo pokazuje ~2,5-struko povećanje signala, vjerojatno zbog različitih preferencija reaktivnosti između RNA i proteina (Slika 1b, c).化学 的 化学 探针 1 和 3 具有 好 的 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 在 线 粒体 中 稳定 表达 表达 中 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 而 用 于 于 于 于 于 于 标记 方法 CAP-seq 探针 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAKemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina imale su bolju specifičnost, HEK293T je stabilno eksprimirao miniSOG u mitohondrijima, a sonda 3 imala je više od 8 puta povećanje signala, dok je sonda 2 za metodu označavanja CAP-seq RNA pokazala samo ~2,5 puta povećanje.u signalu, vjerojatno zbog različitih preferencija reakcije između RNA i proteina (Slika 1b, c).Osim toga, ispitani su izomeri sonde 3 i hidrazinske sonde (sonde 5, 6, 7), potvrđujući optimizaciju sonde 3 (dodatna slika 1b,c).Slično tome, analiza fluorescencije u gelu otkrila je druge optimizirane eksperimentalne parametre: valnu duljinu zračenja (460 nm), koncentraciju kemijske sonde (1 mM) i vrijeme zračenja (20 min) (dodatna slika 2a-c).Izostavljanje bilo koje komponente ili koraka u PDPL protokolu rezultiralo je značajnim preokretom signala u pozadinu (slika 1d).Značajno je da je označavanje proteina značajno smanjeno u prisutnosti natrijevog azida ili troloksa, za koje je poznato da gase singletni kisik.Prisutnost D2O, za koji je poznato da stabilizira singletni kisik, pojačava signal označavanja.Kako bi se istražio doprinos drugih reaktivnih vrsta kisika označavanju, dodani su manitol i vitamin C kako bi se uspostavili hvatači hidroksilnih i superoksidnih radikala, 18, 29, ali nije utvrđeno da smanjuju označavanje.Dodavanje H2O2, ali ne i osvjetljenje, nije rezultiralo označavanjem (dodatna slika 3a).Fluorescentno snimanje singletnog kisika sa Si-DMA sondama potvrdilo je prisutnost singletnog kisika u žici HEK293T-miniSOG, ali ne i u izvornoj žici HEK293T.Osim toga, mitoSOX Red nije mogao otkriti proizvodnju superoksida nakon osvjetljavanja (Slika 1e i Dodatna slika 3b) 30. Ovi podaci snažno sugeriraju da je singletni kisik glavna reaktivna vrsta kisika odgovorna za naknadno proteomsko označavanje.Citotoksičnost PDPL-a je procijenjena uključujući zračenje plavim svjetlom i kemijske sonde, i nije primijećena značajna citotoksičnost (dopunska slika 4a).
Kako bismo proučili mehanizam označavanja i omogućili proteomsku identifikaciju proteinskih kompleksa pomoću LC-MS/MS, prvo moramo odrediti koje su aminokiseline modificirane i delta masu oznaka sonde.Zabilježeno je da su metionin, histidin, triptofan i tirozin modificirani singletnim kisikom14,15.Mi integriramo tijek rada TOP-ABPP31 s nepristranim otvorenim pretraživanjem koje pruža FragPipe računalna platforma temeljena na MSFragger32.Nakon modifikacije singletnog kisika i označavanja kemijskom sondom, izvedena je klik kemija korištenjem biotinske redukcijske oznake koja sadrži poveznicu koja se može cijepati, nakon čega je uslijedilo rastezanje neutravidinom i digestija tripsinom.Modificirani peptid, još uvijek vezan za smolu, je fotocijepan za LC-MS/MS analizu (Slika 2a i Dodatni podaci 1).Veliki broj modifikacija dogodio se u cijelom proteomu s više od 50 navedenih podudaranja peptidne mape (PSM) (slika 2b).Iznenađujuće, primijetili smo samo modifikaciju histidina, vjerojatno zbog veće reaktivnosti oksidiranog histidina prema anilinskim probama od drugih aminokiselina.Prema objavljenom mehanizmu oksidacije histidina pomoću singletnog kisika,21,33 predložena struktura delta-mase od +229 Da odgovara aduktu sonde 3 s 2-okso-histidinom nakon dvije oksidacije, dok je +247 Da proizvod hidrolize od +229 Da (dopunska slika 5).Procjena MS2 spektra pokazala je visoku pouzdanost identifikacije većine y i b iona, uključujući identifikaciju modificiranih fragmentnih iona (y i b) (slika 2c).Analiza konteksta lokalne sekvence PDPL-modificiranih histidina otkrila je umjerenu preferenciju motiva za male hidrofobne ostatke na ±1 položajima (dodatna slika 4b).U prosjeku je identificirano 1,4 histidina po proteinu, a mjesta ovih markera određena su analizom površine dostupne otapalu (SASA) i relativne dostupnosti otapala (RSA) (dodatna slika 4c,d).
Nepristran tijek rada za proučavanje rezidualne selektivnosti pomoću računalne platforme FragPipe koju pokreće MSFragger.Linkeri koji se mogu cijepati koriste se u Click kemiji kako bi se omogućilo fotocijepanje modificiranih peptida iz smole streptavidina.Pokrenuta je otvorena pretraga kako bi se identificirale brojne izmjene, kao i relevantni ostaci.b Dodijelite masu modifikacija koje se javljaju u cijelom proteomu.PSM mapiranje peptida.c MS2 spektralna oznaka histidinskih mjesta modificiranih sondom 3. Kao reprezentativan primjer, kovalentna reakcija sa sondom 3 dodala je +229,0938 Da modificiranoj aminokiselini.d Test mutacije koji se koristi za testiranje PDPL markera.PRDX3 (H155A, H225A) i PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transficirani su divljim tipom plazmida za anti-Flag detekciju.e Sintetski peptid je reagirao s pročišćenim miniSOG u prisutnosti sonde 3 i odgovarajući produkti s Δm +247 i +229 zabilježeni su u LC-MS spektru.f In vitro interakcije protein-protein modelirane miniSOG-6xHis-tagom i anti-6xHis antitijelima.Antibiotin (streptavidin-HRP) i anti-mišja Western blot analiza kompleksa miniSOG-6xHis/anti-6xHis antitijela obilježenih sondom 3, ovisno o vremenu izlaganja svjetlu.Oznake za pojedinačne proteine izražene su odgovarajućom molekularnom težinom: laki lanac LC antitijela, teški lanac HC antitijela.Ovi eksperimenti su neovisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.
Za biokemijsku provjeru mjesta označavanja, PRDX3 i PRDX1 identificirani masenom spektrometrijom promijenjeni su iz histidina u alanin i uspoređeni s divljim tipom u testovima transfekcije.Rezultati PDPL-a pokazali su da je mutacija značajno smanjila označavanje (slika 2d).U međuvremenu, peptidne sekvence identificirane u otvorenom pretraživanju sintetizirane su i reagirale su in vitro s pročišćenim miniSOG u prisutnosti sonde 3 i plavog svjetla, dajući proizvode s pomakom mase od +247 i +229 Da kada je detektirano pomoću LC-MS (slika 2e).).Kako bismo ispitali mogu li se interakcijski proksimalni proteini obilježiti in vitro kao odgovor na miniSOG fotoaktivaciju, dizajnirali smo test umjetne blizine interakcijom između miniSOG-6xHis proteina i anti-His monoklonskog protutijela in vitro (Slika 2f).U ovom testu očekivali smo proksimalno obilježavanje teških i lakih lanaca antitijela s miniSOG.Zapravo, anti-mišji (prepoznavanje teških i lakih lanaca anti-6xHis-obilježenih antitijela) i streptavidin Western blotovi pokazali su jaku biotinilaciju teških i lakih lanaca.Naime, primijetili smo autobiotinilaciju miniSOG zbog oznake 6xHis i poprečnih veza između lakih i teških lanaca, što može biti povezano s prethodno opisanim jazom između proksimalnog odgovora lizina i 2-okso-histidina.Zaključno, zaključujemo da PDPL modificira histidin na način ovisan o blizini.
Naš sljedeći cilj bio je karakterizirati subcelularni proteom kako bismo testirali specifičnost in situ označavanja.Stoga smo stabilno eksprimirali miniSOG u jezgri, mitohondrijskom matriksu ili vanjskoj ER membrani HEK293T stanica (slika 3a).Analiza fluorescencije gela otkrila je obilje obilježenih traka na tri podstanična mjesta kao i različite uzorke označavanja (slika 3b).Analiza fluorescentne slike pokazala je visoku specifičnost PDPL (slika 3c).Tijek rada PDPL-a praćen je reakcijama klika s rodaminskim bojama za ocrtavanje subcelularnih proteoma korištenjem fluorescentne mikroskopije, a PDPL signali su kolokalizirani s DAPI-jem, mitohondrijskim tragačima ili ER tragačima, potvrđujući visoku vjernost PDPL-a.Za tri lokacije organela, usporedna usporedba PDPL-a s TurboID-om pomoću avidinskog western blota pokazala je da je PDPL označen preciznije u usporedbi s njihovim odgovarajućim kontrolama.U uvjetima PDPL pojavilo se više označenih traka, što ukazuje na više proteina obilježenih PDPL (dodatna slika 6a-d).
a Shematski prikaz obilježavanja proteoma specifičnog za organele posredovanog miniSOG-om.miniSOG cilja mitohondrijski matriks fuzijom na N-terminalne 23 aminokiseline humanog COX4 (mito-miniSOG), jezgru fuzijom s H2B (nukleus-miniSOG) i Sec61β putem citoplazmatske strane ER membrane (ER-miniSOG ).Indikacije uključuju snimanje gelom, konfokalno snimanje i masenu spektrometriju.b Reprezentativne gel slike triju PDPL profila specifičnih za organele.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentativne konfokalne slike HEK293T stanica koje stabilno izražavaju miniSOG s različitim subcelularnim lokalizacijama otkrivenim antitijelima označenim V5 (crveno).Substanični markeri koriste se za mitohondrije i ER (zeleno).Tijek rada PDPL-a uključuje otkrivanje subcelularnih proteoma označenih miniSOG (žuto) pomoću kemije klika Cy3-azida.Mjerna traka: 10 µm.d Vulkanski dijagrami PDPL-označenih proteoma u različitim organelama kvantificirani neobilježenom kvantifikacijom (n = 3 neovisna biološka eksperimenta).Dvostrani Studentov t-test korišten je na dijagramima vulkana.Divlji tip HEK293T korišten je kao negativna kontrola. Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona). Značajno izmijenjene bijele boje istaknute su crvenom bojom (p < 0,05 i >2-kratna razlika u intenzitetu iona). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Značajno izmijenjene bijele boje označene crvenom bojom (p < 0,05 i > 2-kratna raznina u ionskoj boji). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i > 2 puta razlika u ionskoj jakosti).Srodni proteini važni za HEK293T-miniSOG, ali nisu važni za HEK293T prikazani su zelenom bojom.e Analiza specifičnosti proteomskih skupova podataka iz eksperimenata d.Na vrhu je označen ukupan broj statistički značajnih proteina u svakoj organeli (crvene i zelene točke).Histogrami pokazuju proteine lokalizirane u organelama na temelju MitoCarta 3.0, GO analize i A. Ting et al.narod.Odvojeni skupovi podataka za mitohondrije, jezgre i ER.Ovi eksperimenti su neovisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Potaknuti rezultatima gela i snimanja, kvantifikacija bez obilježavanja korištena je za kvantificiranje identificiranog proteoma u svakoj organeli (Dodatni podaci 2).Netransfektirani HEK293T korišten je kao negativna kontrola za oduzimanje pozadinskih markera. Analiza grafikona vulkana pokazala je značajno obogaćene proteine (p < 0,05 i >dvostruki intenzitet iona), kao i jednostruke proteine koji su prisutni samo u linijama s ekspresijom miniSOG (Sl. 3d crvene i zelene točke). Analiza grafikona vulkana pokazala je značajno obogaćene proteine (p < 0,05 i >dvostruki intenzitet iona), kao i jednostruke proteine koji su prisutni samo u linijama s ekspresijom miniSOG (Sl. 3d crvene i zelene točke). Analiza grafike vulkana pokazala je značajno obogaćene crte (p <0, 05 i > 2-kratna intenzivnost iona), kao i pojedinačne crte, koje su prisutne samo u linijama, ekspresirajući miniSOG (ris. 3d, crvene i zelene točke). Analiza grafikona vulkana pokazala je značajno obogaćene proteine (p<0,05 i >dvostruki intenzitet iona), kao i pojedinačne proteine koji su prisutni samo u linijama s ekspresijom miniSOG (Slika 3d, crvene i zelene točke).火山图 分析 显示 出 显着 显着 富集 的 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子）） 以及 仅 存 在于 存 在于 存 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色点）））））））））））））））））））））））））））））） 绿色点 蛋白质 （（（绿色点 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一.火山图 分析 显示 出 显着 显着 的 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 单一 蛋白质 蛋白质 （图 图 图 图 图 图 3d 红色 。。。 。。。）））））） Analizom grafikona vulkana otkrivene su značajno obogaćene točke (p <0, 05 i> 2x ionska sila), kao i posebne oznake koje su prisutne samo u ekspresionoj liniji miniSOG (crvene i zelene točke na slici 3d). Analiza grafikona vulkana otkrila je značajno obogaćene proteine (p<0,05 i >2x ionsku snagu), kao i pojedinačne proteine prisutne samo u ekspresijskoj liniji miniSOG (crvene i zelene točke na slici 3d).Kombinirajući ove podatke, identificirali smo 1364, 461 i 911 statistički značajnih nuklearnih, mitohondrijskih i ER proteina vanjske membrane.Za analizu točnosti PDPL-a lokaliziranog na organele upotrijebili smo MitoCarta 3.0, analizu genske ontologije (GO) i A. Ting et al.skup podataka8 korišten je za mitohondrije, jezgru i ER za testiranje specifičnosti organela detektiranih proteina, što odgovara točnosti od 73,4, 78,5 i 73,0% (slika 3e).Specifičnost PDPL potvrđuje da je PDPL idealan alat za identifikaciju proteoma specifičnih za organele.Značajno je da je submitohondrijska analiza identificiranih mitohondrijskih proteina pokazala da je zarobljeni proteom uglavnom raspoređen u matriksu i unutarnjoj membrani (226 odnosno 106), što čini 91,7% (362) od ukupnog broja identificiranih mitohondrijskih proteina.dodatno je potvrđena visoka razina PDPL (dodatna slika 7a).Slično, subnuklearna analiza je pokazala da je zarobljeni proteom uglavnom raspoređen u jezgri, nukleoplazmi i jezgrici (dodatna slika 7b).Nuklearna proteomska analiza s nuklearnim lokalizacijskim signalnim peptidom (3xNLS) pokazala je sličnu točnost kao H2B konstrukt (dodatna slika 7c-h).Kako bi se odredila specifičnost PDPL markera, nuklearni laminin A odabran je kao diskretnije lokalizirana zamka POI7.PDPL je identificirao 36 značajno obogaćenih proteina, od kojih su 12 proteina (30,0% uključujući lamin A) bili dobro okarakterizirani proteini u interakciji s laminom A označeni u bazi podataka String, s većim postotkom od metode BioID (122 proteina) 28 od 28. , 22,9 %) 7. Naša je metoda identificirala manje proteina, vjerojatno zbog ograničenih područja označavanja, što je omogućeno aktivnijim singletnim kisikom.GO analiza pokazala je da su identificirani proteini uglavnom smješteni u nukleoplazmi (26), nuklearnoj membrani (10), nuklearnoj membrani (9) i nuklearnim porama (5).Zajedno, ti proteini lokalizirani u jezgri činili su 80% obogaćenih proteina, dodatno pokazujući specifičnost PDPL (dodatna slika 8a-d).
Nakon što smo utvrdili sposobnost PDPL-a da izvrši označavanje blizine u organelama, zatim smo testirali može li se PDPL koristiti za analizu partnera koji vežu POI.Konkretno, nastojali smo definirati PDPL analizu citosolnih proteina, koji se smatraju težim ciljevima od svojih membranski lokaliziranih parnjaka zbog svoje vrlo dinamične prirode.Bromodomena i ekstraterminalni (BET) protein BRD4 privukli su našu pozornost zbog svoje ključne uloge u raznim bolestima 35, 36.Kompleks formiran od BRD4 je transkripcijski koaktivator i važan terapeutski cilj.Regulirajući ekspresiju transkripcijskih faktora c-myc i Wnt5a, smatra se da je BRD4 ključna determinanta akutne mijeloične leukemije (AML), multiplog mijeloma, Burkittovog limfoma, raka debelog crijeva i upalnih bolesti37,38.Osim toga, neki virusi ciljaju BRD4 za regulaciju virusne i stanične transkripcije, poput papilomavirusa, HIV-a i SARS-CoV-236,39.
Za mapiranje interakcije BRD4 pomoću PDPL-a, kombinirali smo miniSOG s kratkim N- ili C-terminalnim izoformom BRD4.Proteomski rezultati otkrili su visok stupanj preklapanja između dva konstrukta (dopunska slika 9a).Nuklearni proteom identificiran s miniSOG-H2B pokriva 77,6% proteina koji su u interakciji s BRD4 (dodatna slika 9b).Zatim su korištena različita vremena osvjetljavanja (2, 5, 10, 20 min) za podešavanje radijusa markera (Sl. 4a i dodatni podaci 3).Zaključujemo da će u kraćim razdobljima fotoaktivacije PDPL prvenstveno označiti izravne partnere vezanja, dok će duža razdoblja uključivati proteine identificirane tijekom kraćih razdoblja fotoaktivacije, kao i neizravne mete u kompleksima za označavanje.Zapravo, pronašli smo snažno preklapanje između susjednih vremenskih točaka (84,6% za 2 i 5 min; 87,7% za 5 i 10 min; 98,7% za 10 i 20 min) (Slika 4b i Dodatna slika 9c).U svim eksperimentalnim skupinama pronašli smo ne samo BRD4 samooznačavanje, već i nekoliko poznatih ciljeva kao što su MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A i HMGB1 označenih u bazi podataka nizova.Ionska snaga ovih meta proporcionalna je vremenu izlaganja (slika 4c i dopunska slika 9d).GO analiza proteina identificiranih u 2-minutnoj skupini pokazala je da su identificirani proteini bili lokalizirani u jezgri i bili uključeni u remodeliranje kromatina i funkciju RNA polimeraze.Molekularna funkcija proteina obogaćena je vezanjem kromatina ili koaktivacijom transkripcije, u skladu s funkcijom BRD4 (Slika 4d).Analiza interakcije proteina omogućena bazom podataka nizova otkrila je prvu razinu neizravnih interakcija između BRD4 i HDAC obiteljskih kompleksa kao što su SIN3A, NCOR2, BCOR i SAP130 (Slika 4e i Dodatna slika 9e), u skladu s BRD4 i HDAC koji vežu acetilirane histone ..Uz to, reprezentativni ciljevi identificirani pomoću LC-MS/MS, uključujući Sin3A, NSUN2, Fus i SFPQ, potvrđeni su Western blotingom (Slika 4f).Nedavno je objavljeno da kratka izoforma BRD4 tvori jezgre sa svojstvima odvajanja faze tekućina-tekućina (LLPS).Proteini koji vežu RNK Fus i SFPQ posreduju u LLPS-u raznih staničnih procesa i ovdje su identificirani kao nezabilježeni proteini vezanja BRD4.Interakcija između BRD4 i SFPQ potvrđena je eksperimentima ko-imunoprecipitacije (co-IP) (Slika 4g), što ukazuje na još jedan mehanizam za odvajanje faze tekućina-tekućina posredovan BRD4 koji zaslužuje daljnje istraživanje.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je PDPL idealna platforma za identifikaciju poznatih BRD4 međudjelovanja kao i nepoznatih veznih proteina.
a Shematski prikaz označavanja blizine BRD4 posredovanog miniSOG-om, vremena izlaganja: 2, 5, 10 i 20 min.b Preklapanje proteina identificiranih u različitim vremenima osvjetljavanja.Obogaćivanje proteina identificirano u HEK293T-miniSOG-BRD4 bilo je statistički značajno u usporedbi s divljim tipom HEK293T.c Intenzitet iona pri kvantificiranju neobilježenih reprezentativnih poznatih proteina koji vežu BRD4 tijekom navedenog vremena izlaganja.n = 3 biološki neovisna uzorka.Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.d Genska ontološka analiza (GO) proteina identificiranih u 2-minutnoj skupini.Navedeno je prvih deset pojmova GO.Mjehurići su obojeni prema kategoriji pojmova GO, a veličina mjehurića proporcionalna je broju proteina koji se nalaze u svakom pojmu.e Analiza nizova proteina u interakciji s BRD4.Žuti krugovi su izravno ljepilo, a sivi krugovi su prvi sloj neizravnog ljepila.Crvene linije predstavljaju eksperimentalno određene interakcije, a plave linije predstavljaju predviđene interakcije.f Reprezentativni ciljevi vezanja BRD4 identificirani u LC-MS/MS verificirani su Western blotom.g Eksperimenti koimunoprecipitacije potvrđuju interakciju između SFPQ i BRD4.Ovi eksperimenti su neovisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Uz identificiranje neregistriranih ciljeva povezanih s POI, pretpostavljamo da će PDPL biti prikladan za identificiranje supstrata za enzime, što bi zahtijevalo karakterizaciju neizravnih veznih proteina u velikim kompleksima za označavanje neregistriranih supstrata.Parkin (kodiran PARK2) je E3 ligaza i poznato je da mutacije u parkinu uzrokuju autosomno recesivnu juvenilnu Parkinsonovu bolest (AR-JP)42.Osim toga, parkin je opisan kao bitan za mitofagiju (mitohondrijska autofagija) i uklanjanje reaktivnih kisikovih vrsta.Međutim, iako je identificirano nekoliko supstrata parkina, uloga parkina u ovoj bolesti ostaje nejasna.Kako bi se označili njegovi nekarakterizirani supstrati, PDPL je testiran dodavanjem miniSOG na N- ili C-kraj parkina.Stanice su tretirane karbonil cijanidnim protonskim transporterom m-klorofenilhidrazonom (CCCP) da se aktivira parkin putem PINK1-Parkinovog puta.U usporedbi s našim rezultatima BRD4 PDPL, fuzija N-terminusa parkina otkrila je veći skup ciljnih proteina, iako je pokrila veći dio C-terminusa (177 od 210) (Slika 5a,b i Dodatni podaci 4).rezultat je u skladu s izvješćima da N-terminalne oznake mogu nenormalno aktivirati Parkin44.Iznenađujuće, bilo je samo 18 preklapajućih proteina u našim podacima s objavljenim AP-MS rezultatima za Parkin43, vjerojatno zbog razlika između staničnih linija i proteomičkih radnih procesa.Uz četiri poznata proteina (ARDM1, HSPA8, PSMD14 i PSMC3) identificirana dvjema metodama (Sl. 5c)43.Kako bi se dodatno potvrdili rezultati LC-MS/MS, PDPL tretman i naknadni Western blotting korišteni su za usporedbu rezultata HEK293T testa matičnih stanica i stabilne N-terminalne parkin linije.Prethodno nepoznate mete CDK2, DUT, CTBP1 i PSMC4 testirane su s poznatim vezivom, DNAJB1 (Slika 5d).
Vulkanski prikaz proteina u interakciji s parkinom u stanicama HEK293T sa stabilno eksprimiranim miniSOG spojenim na N- ili C-kraj parkina (n = 3 neovisna biološka eksperimenta).Dvostrani Studentov t-test korišten je na dijagramima vulkana.HEK293T korišten je kao negativna kontrola. Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona). Značajno izmijenjene bijele boje istaknute su crvenom bojom (p < 0,05 i >2-kratna razlika u intenzitetu iona). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i >2 puta razlika u intenzitetu iona).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异＂）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Značajno izmijenjene bijele boje označene crvenom bojom (p < 0,05 i > 2-kratna raznina u ionskoj boji). Značajno promijenjeni proteini označeni su crvenom bojom (p < 0,05 i > 2 puta razlika u ionskoj jakosti).Srodni proteini važni za HEK293T-miniSOG, ali nisu važni za HEK293T prikazani su zelenom bojom.b Vennov dijagram koji prikazuje preklapajuće proteine između N-terminalnih i C-terminalnih konstrukata.N-terminalne oznake mogu nenormalno aktivirati parkin i rezultirati u prepoznatljivijim proteinima.c Vennov dijagram koji prikazuje preklapajuće proteine između PDPL i AP-MS.Navedeni su poznati interaktori, uključujući 4 od 18 proteina koji se preklapaju i 11 od 159 proteina koji su specifično identificirani u PDPL.d Reprezentativni ciljevi identificirani pomoću LC-MS/MS verificirani su Western blotom.e Ssu72 i SNW1 identificirani su kao neregistrirani supstrati parkina.Ovi FLAG-označeni proteinski plazmidi transficirani su u HEK293T i HEK293T-Parkin-miniSOG nakon čega je uslijedio tretman CCCP u različitim vremenskim točkama.Degradacija je bila izraženija u Parkinovoj liniji prekomjerne ekspresije.f Korištenjem inhibitora proteasoma MG132, potvrđeno je da je proces razgradnje Ssu72 i SNW1 posredovan ubikvitinacijom proteasoma.Ovi eksperimenti su neovisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Naime, proteini koje identificira PDPL moraju uključivati proteine koji vežu parkin i njihove supstrate.Kako bismo otkrili neregistrirane supstrate parkina, odabrali smo sedam identificiranih proteina (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 i SNW1) i transfektirane plazmide kako bismo te gene izložili normalnom HEK293T i stabilno eksprimirali miniSOG-Parkinov HEK293T nakon čega je uslijedio tretman CCCP.Razine proteina Ssu72 i SNW1 bile su značajno smanjene u stabilnoj liniji miniSOG-Parkin (slika 5e).Tretman CCCP-om od 12 sati rezultirao je najznačajnijom degradacijom oba supstrata.Kako bismo istražili je li razgradnja Ssu72 i SNW1 regulirana ubikvitinacijom proteasoma, dodan je inhibitor proteasoma MG132 da inhibira aktivnost proteasoma, i zapravo smo otkrili da je njihov proces razgradnje inhibiran (Slika 5f).Dodatni ciljevi koji nisu supstrati potvrđeni su kao Parkin interaktori korištenjem Western blottinga (dodatna slika 10), koji je pokazao dosljedne rezultate s LC-MS/MS.Zaključno, integracija PDPL radnog procesa s verifikacijom transfekcije ciljanog proteina omogućuje identifikaciju neregistriranih supstrata E3 ligaze.
Razvili smo zajedničku platformu za označavanje blizine koja vam omogućuje prepoznavanje točaka interesa u prostoru i vremenu.Platforma se temelji na fotosenzibilizacijskom proteinu miniSOG, koji je samo oko 12 kDa, što je manje od polovine veličine zrelog enzima APEX2 (27 kDa) i jedne trećine veličine TurboID-a (35 kDa).Manja veličina trebala bi znatno proširiti raspon primjena za proučavanje malih proteinskih interaktoma.Daljnje istraživanje dodatnih fotosenzibilizatora, bilo genetski kodiranih proteina ili malih molekula, potrebno je za povećanje kvantnog prinosa singletnog kisika i proširenje osjetljivosti ovog pristupa.Za trenutnu verziju miniSOG-a, visoka vremenska razlučivost može se postići korištenjem plavog osvjetljenja za aktiviranje oznaka blizine.Osim toga, dulje vrijeme izlaganja oslobodilo je veći "oblak" singletnog kisika, što je rezultiralo modifikacijom distalnijih histidinskih ostataka, povećanim radijusom označavanja i mogućnošću finog podešavanja prostorne rezolucije PDPL.Također smo testirali sedam kemijskih sondi za povećanje omjera signala i pozadine i istražili molekularni mehanizam iza ovog pristupa.Tijek rada TOP-ABPP u kombinaciji s nepristranim otvorenim pretraživanjem potvrdio je da su se modifikacije dogodile samo u histidinima i nije primijećeno dosljedno mikrookruženje za povećane modifikacije histidina, osim umjerene sklonosti histidinima u području petlje.
PDPL se također koristi za karakterizaciju subcelularnih proteoma sa specifičnošću proteoma i pokrivenošću koja je barem usporediva s drugim metodama kemijskog ispitivanja specifičnim za blizinu i organele.Markeri blizine također su uspješno korišteni za karakterizaciju površinskih, lizosomalnih i proteoma povezanih sa sekretomom46,47.Vjerujemo da će PDPL biti kompatibilan s tim subcelularnim organelama.Osim toga, osporili smo PDPL identificiranjem ciljeva za vezanje citosolnih proteina koji su složeniji od proteina vezanih na membranu zbog svojih dinamičkih svojstava i uključenosti u više vremenskih interakcija.PDPL je primijenjen na dva proteina, transkripcijski koaktivator BRD4 i ligazu E3 Parkin povezanu s bolešću.Ova dva proteina odabrana su ne samo zbog svojih temeljnih bioloških funkcija, već i zbog njihove kliničke važnosti i terapeutskog potencijala.Za ove dvije točke interesa identificirani su dobro poznati obvezujući partneri kao i neregistrirani ciljevi.Naime, protein SFPQ povezan s odvajanjem faza potvrđen je ko-IP-om, što može ukazivati na novi mehanizam kojim BRD4 (kratki izoform) regulira LLPS.Istodobno, vjerujemo da je identifikacija Parkin podloga scenarij u kojem je potrebna identifikacija neizravnih ljepila.Identificirali smo dva neidentificirana supstrata parkina i potvrdili njihovu razgradnju duž putanje ubikvitinacije-proteasoma.Nedavno je razvijena strategija hvatanja temeljena na mehanizmu za otkrivanje supstrata hidrolaze njihovim hvatanjem enzimima.Iako je ovo vrlo moćna metoda, nije prikladna za analizu supstrata koji su uključeni u stvaranje velikih kompleksa i zahtijeva stvaranje kovalentnih veza između enzima i supstrata.Očekujemo da se PDPL može proširiti na proučavanje drugih proteinskih kompleksa i obitelji enzima, kao što su obitelji deubikvitinaza i metaloproteaza.
Novi oblik miniSOG, nazvan SOPP3, razvijen je s poboljšanom proizvodnjom singletnog kisika.Usporedili smo miniSOG sa SOPP3 i pronašli poboljšane performanse označavanja, iako je omjer signala i šuma ostao nepromijenjen (dodatna slika 11).Pretpostavili smo da bi optimizacija SOPP3 (npr. putem usmjerene evolucije) dovela do učinkovitijih fotosenzibilizirajućih proteina koji zahtijevaju kraće svjetlosno vrijeme i tako omogućili hvatanje dinamičnijih staničnih procesa.Naime, trenutna verzija PDPL-a ograničena je na stanično okruženje budući da zahtijeva osvjetljenje plavim svjetlom i ne može prodrijeti u duboka tkiva.Ova značajka onemogućuje njegovu upotrebu u studijama na životinjskim modelima.Međutim, kombinacija optogenetike s PDPL-om mogla bi pružiti priliku za istraživanje na životinjama, posebice u mozgu.Osim toga, drugi projektirani infracrveni fotosenzibilizatori također uklanjaju ovo ograničenje.Trenutno su u tijeku istraživanja na ovom području.
Stanična linija HEK293T dobivena je od ATCC (CRL-3216).Stanična linija je testirana negativno na infekciju mikoplazmom i uzgojena je u DMEM (Thermo, #C11995500BT) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Vistech, #SE100-B) i 1% penicilina/streptomicina (Hyclone, #SV30010).odrastao u.
3-aminofenilen (uzorak 3) i (4-etinilfenil)metanamin (uzorak 4) kupljeni su od Bidepharma.Propilamin (sonda 2) je nabavljen od Energy-chemicals.N-(2-aminofenil)pent-4-inamid (sonda 1) sintetiziran je prema objavljenim metodama.
Dodatna tablica 1 navodi genetske konstrukte korištene u ovoj studiji.MiniSOG i KillerRed sekvence klonirane su iz darovanog plazmida P. Zou (Pekinško sveučilište).Ciljna sekvenca mitohondrijskog matriksa izvedena je iz 23 N-terminalne aminokiseline COX4 i klonirana u naznačene vektore korištenjem Gibson sklopa (Beyotime, #D7010S).Za ciljanje membrane i jezgre endoplazmatskog retikuluma, SEC61B ljudska DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) umnožena PCR-om iz cDNA biblioteke HEK293T stanica, i H2B DNA (donirao D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) i klonirano, kao što je gore spomenuto.Osim ako nije drugačije naznačeno, drugi proteinski geni korišteni za transfekciju i konstrukciju stabilnih staničnih linija su PCR amplificirani iz HEK293T stanične cDNA biblioteke.G3S (GGGS) i G4S (GGGGS) korišteni su kao poveznici između proteina mamca i miniSOG.Oznaka V5 epitopa (GKPIPNPLLGLDST) dodana je ovim fuzijskim konstruktima.Za ekspresiju kod sisavaca i za uspostavljanje stabilne stanične linije, miniSOG fuzijski konstrukt subkloniran je u pLX304 lentivirusni vektor.Za bakterijsku ekspresiju, miniSOG je kloniran u pET21a vektor označen 6xHis na C-kraju.
Stanice HEK293T nasađene su u količini od 2,0 x 105 stanica po jažici u ploče sa šest jažica i transficirane 24 sata kasnije s rekombinantnim lentivirusnim plazmidima (2,4 μg pLX304) i plazmidima za pakiranje virusa (1,5 μg psPAX2 i 1,2 μg pMD2.G) upotrebom Lipo8000 (Beyotime). , #C0533), oko 80% fuzije.Nakon transfekcije preko noći, medij je promijenjen i inkubiran još 24 sata.Sakupljanje virusa obavljeno je nakon 24, 48 i 72 sata.Prije infekcije ciljnih staničnih linija, virusni medij je filtriran kroz filter od 0,8 μm (Merck, #millex-GP) i dodan je polibrene (Solarbio, #H8761) do koncentracije od 8 μg/ml.Nakon 24 sata, stanice su ostavljene da se oporave promjenom medija.Stanice su odabrane korištenjem 5 μg/ml blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) za prva tri prolaza kao niže stroga selekcija.Zatim je korišteno 20 μg/ml kao stroži režim za sljedeća tri prolaza.
Stanice su nasađene u komore s 12 jažica (Ibidi, #81201) pri gustoći od približno 20.000 stanica po jažici.Kako biste poboljšali prianjanje stanica HEK293T, dodajte 50 µg/ml fibronektina (Corning, #356008) razrijeđenog u fosfatnom puferiranom slanom otopinom (PBS, Sangon, #B640435) na 37°C.Komore su prethodno tretirane 1 sat i zatim uklonjene s PBS-om.Nakon 24 h, stanice su isprane jednom s PBS-om, inkubirane s 1 mM sondom 3 u svježoj Hanksovoj uravnoteženoj otopini soli (HBSS, Gibco, #14025092) 1 h na 37 °C, a zatim inkubirane s plavom LED diodom (460 nm ).) ozračeni su 10 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon toga, stanice su isprane dva puta s PBS-om i fiksirane s 4% formaldehidom u PBS-u (Sangon, #E672002) 15 minuta na sobnoj temperaturi.Višak formaldehida je uklonjen iz fiksnih stanica ispiranjem tri puta s PBS.Stanice su zatim permeabilizirane s 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) u PBS-u i isprane 3 puta s PBS-om.Zatim uklonite komoru i dodajte svakom uzorku 25 µl smjese za klik reakciju koja sadrži 50 µM Cy3-azida (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) i 0,5 mg/ml natrijevog askorbata (Aladdin, br. S105024) i inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon brze reakcije, stanice su isprane šest puta s PBS-om koji je sadržavao 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) i zatim blokirane s 5% BSA (Abcone, #B24726) u PBST-u 30 minuta na sobnoj temperaturi.
Za kolokalizacijsko imunološko bojenje, stanice su inkubirane s primarnim protutijelima u skladu s navedenim uvjetima: mišje anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), zečje anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), zečje poliklonsko anti-kalneksinsko protutijelo (1:500, Abcam, #ab22595) ili zečje anti-lamin A/C monoklonsko protutijelo (1:500; CST, #2032) na 4 °C preko noći.Nakon ispiranja 3 puta s PBST, stanice su inkubirane sa sekundarnim protutijelima: kozji anti-zečji Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) razrijeđen 1:1000, kozji anti-mišji Alexa Fluor 594 (CST, #8889) razrijeđen 1:1000.razrjeđivanje Razrijediti na sobnoj temperaturi 30 minuta.Stanice su zatim isprane 3 puta s PBST i obojene s DAPI (Thermo, #D1306) u PBS-u 10 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon 3 ispiranja s PBS-om, stanice su zapečaćene u 50% glicerolu (Sangon, #A600232) u PBS-u za snimanje.Imunofluorescentne slike dobivene su konfokalnim mikroskopom ZEISS LSM 900 Airyscan2 i softverom ZNE 3.5.
Za fluorescentno oslikavanje singletnim kisikom, stanice su isprane dva puta Hanks HEPES puferom prije dodavanja 100 nM Si-DMA u Hanks HEPES pufer (DOJINDO, #MT05).Nakon izlaganja svjetlu, stanice su inkubirane u CO2 inkubatoru na 37°C 45 minuta.Stanice su zatim isprane dva puta s Hanksovim HEPES puferom i obojene Hoechstom u Hanksovom HEPES puferu 10 minuta na sobnoj temperaturi i vizualizirane pomoću ZEISS LSM 900 konfokalnog mikroskopa., #M36008) u HBSS puferu koji sadrži kalcij i magnezij.Nakon izlaganja svjetlu ili doksorubicinu (MCE, #HY-15142A), stanice su inkubirane u CO2 inkubatoru na 37°C tijekom 10 minuta, isprane dva puta s HBSS puferom i inkubirane s Hoechstom u HBSS puferu na sobnoj temperaturi.minuta.Doksorubicin je korišten kao pozitivna kontrola probe gdje su stanice tretirane s 20 µM doksorubicina u HBSS-u koji je sadržavao 1% BSA tijekom 30 minuta.Imunofluorescentne slike dobivene su konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM 900.
HEK293T stanice koje stabilno eksprimiraju mito-miniSOG nasađene su u gustoći od približno 30% u zdjelice od 15 cm.Nakon 48 sati, kada je postignuta ~80% konfluencija, stanice su isprane jednom s PBS-om, inkubirane s 1 mM probe 3 u svježem HBSS puferu 1 sat na 37°C i zatim osvijetljene plavim LED-om 10 minuta na sobnoj temperaturi. temperatura..Nakon toga, stanice su isprane dva puta s PBS-om, ostrugane i resuspendirane u ledeno hladnom PBS puferu koji sadrži inhibitore proteaze bez EDTA (MCE, #HY-K0011).Stanice su lizirane sonikacijom vrha tijekom 1 minute (1 sekunda uključena i 1 sekunda isključena pri 35% amplitudi).Rezultirajuća smjesa je centrifugirana na 15,871 xg tijekom 10 minuta na 4°C kako bi se uklonili ostaci, a koncentracija supernatanta je podešena na 4 mg/mL pomoću kompleta za analizu BCA proteina (Beyotime, #P0009).Pomiješajte 1 ml gornjeg lizata s 0,1 mM fotorazgradivog biotin azida (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA liganda (Aladdin, #T162437) i 1 mM CuSO4 inkubatora s dnom rotirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.Nakon brze reakcije, dodajte smjesu u prethodno izmiješanu otopinu (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) u staklenoj bočici od 10 ml.Uzorci su pomiješani i centrifugirani na 4500 g 10 minuta na sobnoj temperaturi.Donja i gornja otopina su odbačene, talog je ispran dva puta sa 1 ml metanola i centrifugiran na 15871 x g 5 minuta na 4°C.Dodajte 1 ml 8 M uree (Aladdin, br. U111902) u 25 mM amonijevog bikarbonata (ABC, Aladdin, br. A110539) kako biste otopili talog.Uzorci su rekonstituirani s 10 mM ditiotreitola (Sangon, #A100281 u 25 mM ABC) 40 minuta na 55°C nakon čega je dodano 15 mM svježeg jodoacetamida (Sangon, #A600539) na sobnoj temperaturi u mraku.Alkilacija unutar 30 minuta..Dodatno je 5 mM ditiotreitola da se zaustavi reakcija.Pripremite približno 100 µl NeutrAvidin agaroznih kuglica (Thermo, #29202) za svaki uzorak ispiranjem 3 puta s 1 ml PBS-a.Gornja otopina proteoma razrijeđena je s 5 ml PBS-a i inkubirana s prethodno ispranim zrncima NeutrAvidin agaroze 4 sata na sobnoj temperaturi.Kuglice su zatim isprane 3 puta s 5 ml PBS-a koji je sadržavao 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 puta s 5 ml PBS-a koji je sadržavao 1M ureu i 3 puta s 5 ml ddH2O.Kuglice su zatim sakupljene centrifugiranjem i resuspendirane u 200 μl 25 mM ABC koji sadrži 1 M ureu, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) i 20 ng/μl tripsina (Promega, #V5280).Tripsinizirajte preko noći na 37°C uz rotaciju.Reakcija je zaustavljena dodavanjem mravlje kiseline (Thermo, # A117-50) dok pH nije dosegao 2-3.Kuglice su isprane 3 puta s 1 ml PBS-a koji sadrži 0,2% SDS, 3 puta s 1 ml PBS-a koji sadrži 1 M ureu, a zatim 3 puta s 1 ml destilirane vode.Modificirani peptidi su otpušteni svjetlosnom lizom (365 nm) tijekom 90 minuta upotrebom 200 μl 70% MeOH.Nakon centrifugiranja, supernatant je sakupljen.Zrnca su zatim jednom isprana sa 100 μl 70% MeOH i supernatanti su skupljeni.Uzorci su osušeni u vakuumskom koncentratoru Speedvac i do analize pohranjeni na -20°C.
Kako bi se identificirali i kvantificirali peptidi modificirani singletnim kisikom, uzorci su ponovno otopljeni u 0,1% mravlje kiseline i 1 μg peptida je analiziran korištenjem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masenog spektrometra opremljenog nano ESI izvorom od Tune i Xcalibur od softvera dobavljača 4.3.Uzorci su odvojeni na 75 µm × 15 cm kapilarnoj koloni s 3 µm C18 materijala (ReproSil-pur, #r13.b9.) i spojeni na EASY-nLC 1200 UHPLC sustav (Thermo).Peptidi su odvojeni linearnom 95-minutnom gradijentnom kromatografijom od 8% otapala B do 50% otapala B (A = 0,1% mravlje kiseline u vodi, B = 0,1% mravlje kiseline u 80% acetonitrilu), zatim linearno povećani do 98% B min u 6 min pri protoku od 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos naizmjenično prikuplja podatke između potpunog MS skeniranja i MS2 skeniranja, ovisno o podacima.Napon raspršivanja postavljen je na 2,1 kV, a temperatura kapilare za prijenos iona bila je 320°C.MS spektri (350-2000 m/z) prikupljeni su s rezolucijom od 120 000, AGC 4 × 105 i maksimalnim ulaznim vremenom od 150 ms.10 najčešćih višestruko nabijenih prekursora u svakom potpunom skeniranju fragmentirano je pomoću HCD-a s normaliziranom energijom sudara od 30%, prozorom kvadrupolne izolacije od 1,6 m/z i postavkom rezolucije od 30 000.AGC cilj za tandemsku masenu spektrometriju koja koristi 5×104 i maksimalno ulazno vrijeme od 150 ms.Dinamička iznimka postavljena je na 30 sekundi. Nedodijeljeni ioni ili oni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Nedodijeljeni ioni ili oni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Neoznačeni ioni ili ioni s punjenjem 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nedodijeljeni ioni ili ioni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani ioni ili ioni s punjenjem 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Neodređeni ioni ili ioni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS.
Neobrađeni podaci obrađuju se pomoću FragPipe računalne platforme koja se temelji na MSFraggeru.Odstupanja mase i odgovarajuće aminokiseline određene su pomoću algoritma otvorenog pretraživanja s tolerancijom mase prekursora od -150 do 500 Da.Modificirani peptidi su zatim identificirani pomoću modifikacija histidina s porastom mase od +229,0964 i +247,1069 Da u PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Stanice koje stabilno eksprimiraju spojeni miniSOG gen nasađene su u posude od 6 cm.Nakon postizanja ~80% konfluencije, stanice su jednom isprane s HBSS (Gibco, #14025092), zatim inkubirane s kemijskim probama u HBSS 1 sat na 37°C i osvijetljene plavim svjetlom.10W LED 20 minuta na sobnoj temperaturi.Kako bi se odredilo koja je vrsta reaktivnih kisikovih vrsta uključena u PDPL, 0,5 mM vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitola (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 dodano je stanicama kao dodatak.Nakon ispiranja s hladnim PBS-om, stanice su ostrugane, sakupljene u centrifugalne epruvete od 1,5 ml i sonikirane vrhom 1 minutu u 200 μl PBS-a s 1x inhibitorom proteaze bez EDTA (1 s i 1 s bez, amplituda 35%).Rezultirajuća smjesa je centrifugirana na 15,871 × g 10 minuta na 4 °C, a koncentracija supernatanta je podešena na 1 mg/mL pomoću kompleta za analizu BCA proteina.Približno 50 µl gornjeg lizata inkubirano je s 0,1 mM rodamin azida (Aladdin, br. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liganda i 1 mM CuSO4 tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi uz rotaciju odozdo prema gore.Nakon reakcije klika, provedeno je taloženje acetonom dodavanjem 250 μl prethodno ohlađenog acetona uzorcima, inkubiranjem na -20°C 20 minuta i centrifugiranjem na 6010×g 10 minuta na 4°C.Prikupite talog i kuhajte u 50 µl 1x Laemmlijevog pufera 10 minuta na 95 °C.Uzorci su zatim analizirani na SDS-PAGE dugim gelovima i vizualizirani korištenjem Bio-rad ChemiDoc MP Touch sustava za snimanje sa softverom Image Lab Touch.
Ekspresija i pročišćavanje rekombinantnog miniSOG-6xHis proteina izvedena je kao što je prethodno opisano.Ukratko, stanice E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) su transformirane s pET21a-miniSOG-6xHis i ekspresija proteina je inducirana s 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Nakon stanične lize, proteini su pročišćeni pomoću Ni-NTA agaroznih kuglica (MCE, br. 70666), dijalizirani protiv PBS-a i pohranjeni na –80°C.
Za in vitro test blizine oznake temeljen na protutijelima, pomiješajte 100 μM pročišćenog miniSOG, 1 mM sonde 3 i 1 μg anti-obilježenog mišjeg monoklonskog protutijela (TransGen, #HT501-01) u PBS do ukupnog reakcijskog volumena od 50 μl..Reakcijska smjesa je ozračena plavim LED svjetlom 0, 2, 5, 10 i 20 minuta na sobnoj temperaturi.Smjesa je inkubirana s 0,1 mM biotin-PEG3-azida (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liganda i 1 mM CuSO4 tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi na mućkalici s pokretom prema gore.Nakon brze reakcije, dodajte 4x Laemmlijev pufer izravno u smjesu i kuhajte na 95°C 10 minuta.Uzorci su analizirani na SDS-PAGE gelovima i analizirani Western blottingom sa streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Sintetski peptid koji sadrži histidin s C-terminalnom amidacijom (LHDALDAK-CONH2) korišten je za analizu in vitro označavanja na bazi obližnjih peptida.U ovom testu, 100 μM pročišćenog miniSOG, 10 mM sonde 3 i 2 μg/ml sintetskog peptida pomiješano je u PBS u ukupnom reakcijskom volumenu od 50 μl.Reakcijska smjesa je ozračena plavim LED svjetlom 1 sat na sobnoj temperaturi.Jedan mikrolitar uzorka analiziran je pomoću LC-MS sustava (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight maseni spektrometar sa softverom za analizu spektra MassLynx).
HEK293T stanice koje stabilno eksprimiraju fuzijski gen miniSOG nasađene su u zdjelice od 10 cm za linije s različitim lokalizacijama organela (Mito, ER, Nucleus) i zdjelice od 15 cm za Parkin-miniSOG i BRD4-miniSOG linije.Nakon postizanja ~90% konfluencije, stanice su jednom isprane s HBSS, zatim inkubirane sa sondom 3 u HBSS 1 sat na 37°C i osvijetljene s 10 W plavim LED na sobnoj temperaturi.Za beskontaktno obilježavanje Parkina, 10 µM proton karbonil cijanid nosač m-klorofenilhidrazon CCCP (Solarbio, #C6700) sa sondom 3 u HBSS je dodan 1 sat na 37°C.Stanična liza, klik kemija, redukcija i koraci alkilacije bili su isti kao što je gore opisano, osim što je dodano 2 mg lizata i biotin PEG3 azid korišten je u klik reakciji umjesto fotorazgradivog biotin azida.Nakon obogaćivanja, kuglice su isprane 3 puta s 5 ml PBS-a koji sadrži 0,2% SDS, 3 puta s 5 ml PBS-a koji sadrži 1 M ureu i 3 puta s 5 ml PBS-a.Nakon toga, 2 ug tripsina je dodano u 300 ul 25 mM ABC koji sadrži 1 M ureu da se cijepa protein preko noći na 37°C.Reakcija je zaustavljena dodavanjem mravlje kiseline dok nije postignut pH od 2-3.Nakon tripsinizacije na zrncima, otopina peptida je odsoljena korištenjem SOLAµ HRP kolone (Thermo, #60209-001) i osušena u Speedvac vakuumskom koncentratoru.Peptidi su ponovno otopljeni u 0,1% mravlje kiseline i 500 ng peptida je analizirano pomoću Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masenog spektrometra opremljenog nano-ESI izvorom opisanim gore.Peptidi su odvojeni na komercijalnim RP-HPLC predkolonama (75 μm x 2 cm) (Thermo, br. 164946) i analitičkim RP-HPLC kolonama (75 μm x 25 cm) (Thermo, br. 164941), obje napunjene s 2 μm.gradijent od 8% do 35% ACN u 60 minuta, zatim linearno povećan do 98% B u 6 minuta pri protoku od 300 Nl/min.MS spektri (350-1500 m/z) prikupljeni su s rezolucijom od 60 000, AGC 4 × 105 i maksimalnim ulaznim vremenom od 50 ms.Odabrani ioni sekvencijalno su fragmentirani pomoću HCD-a u ciklusima od 3 s s normaliziranom energijom sudara od 30%, prozorom kvadrupolne izolacije od 1,6 m/z i razlučivosti od 15000. 5 × 104 tandem masenog spektrometra AGC meta i maksimalno vrijeme ubrizgavanja korišteno je 22 ms.Dinamičko isključenje postavljeno je na 45 sekundi. Nedodijeljeni ioni ili oni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Nedodijeljeni ioni ili oni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Neoznačeni ioni ili ioni s punjenjem 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nedodijeljeni ioni ili ioni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani ioni ili ioni s punjenjem 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Neodređeni ioni ili ioni s nabojem 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS.
Koraci pripreme uzorka do obogaćivanja zrnca NeutrAvidina bili su isti kao u LC-MS/MS analizi opisanoj gore.Otprilike 50 μg lizata korišteno je kao ulaz za kontrolu punjenja, a 2 mg lizata korišteno je za reakcije klika.Nakon obogaćivanja i ispiranja s neutravidinom, vezani proteini su eluirani dodavanjem 50 μl Laemmlijevog pufera kuglicama agarozne smole i kuhanjem na 95°C tijekom 5 minuta.Kontrolni unos i uzorci obogaćeni zrncima analizirani su SDS-PAGE i prebačeni na PVDF membrane (Millipore, #ISEQ00010) standardnim Western blot metodama.Membrane su blokirane s 5% obranim mlijekom (Sangon, #A600669) u TBS-u koji sadrži 0,1% tween-20 (TBST) i inkubirane sekvencijalno s primarnim i sekundarnim protutijelima.Primarna antitijela su razrijeđena 1:1000 u 5% obranom mlijeku u TBST i inkubirana preko noći na 4°C.Sekundarna protutijela korištena su u omjeru 1:5000 i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi.Membrane su vizualizirane kemiluminiscencijom korištenjem Chemidoc MP sustava za oslikavanje.Svi neizrezani skenovi mrlja i gelova na slici prikazani su kao neobrađeni podaci.
Primarna protutijela korištena u ovoj studiji uključivala su zečja anti-SFPQ monoklonska protutijela (CST, br. 71992), zečja anti-FUS monoklonska protutijela (CST, br. 67840), zečja anti-NSUN2 poliklonska protutijela (Proteintech, br. 20854-1- AP), zečje anti-mSin3A poliklonsko antitijelo (Abcam, #ab3479), mišje anti-tag monoklonsko antitijelo (TransGen, #HT201-02), mišje anti-β-aktin monoklonsko antitijelo (TransGen, #HC201-01), zečji antitijelo -CDK2 monoklonsko antitijelo (ABclonal, #A0094), zečje monoklonsko antitijelo na CTBP1 (ABclonal, #A11600), zečje poliklonsko antitijelo na DUT (ABclonal, #A2901), zečje poliklonsko antitijelo na PSMC4 (ABclonal, #A2505), zečje anti- DNAJB1 poliklonsko protutijelo (ABclonal, # A5504).Ova su antitijela korištena u razrjeđenju 1:1000 u 5% obranom mlijeku u TBST.Sekundarna protutijela korištena u ovoj studiji uključivala su anti-zečji IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mišji IgG (TransGen, #HS201-01) u razrjeđenju 1:5000.
Kako bi se dalje istražilo da li BRD4 stupa u interakciju sa SFPQ, stabilne HEK293T i BRD4-miniSOG stanice s prekomjernom ekspresijom HEK293T stavljene su u posude od 10 cm.Stanice su isprane hladnim PBS-om i lizirane u 1 ml Pierce IP pufera za lizu (Thermo Fisher, #87787) s inhibitorom proteaze bez EDTA 30 minuta na 4°C.Nakon toga, lizati su sakupljeni u epruvete za centrifugiranje od 1,5 ml i centrifugirani na 15,871 xg 10 minuta na 4°C.Supernatant je sakupljen i inkubiran s 5 µg anti-V5 obilježenog mišjeg monoklonskog antitijela (CST, #80076) preko noći na 4°C.Dvaput isperite približno 50 µl proteinskih A/G magnetskih kuglica (MCE, #HY-K0202) s PBS-om koji sadrži 0,5% Tween-20.Zatim su stanični lizati inkubirani s magnetskim kuglicama 4 sata na 4°C uz rotaciju odozdo prema gore.Zatim su kuglice isprane četiri puta s 1 ml PBST pufera i kuhane na 95°C 5 minuta.Uzorci su analizirani na SDS-PAGE gelovima i prebačeni na PVDF membrane korištenjem standardnih Western blot metoda.Membrane su blokirane u 5% obranom mlijeku u TBST i inkubirane sekvencijalno s primarnim i sekundarnim protutijelima.Primarno antitijelo Zečje anti-SFPQ monoklonsko antitijelo (CST, #71992) korišteno je u omjeru 1:1000 u 5% obranom mlijeku u TBST i inkubirano preko noći na 4°C.Anti-zečji IgG korišten je u omjeru 1:5000 i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi.Membrane su vizualizirane kemiluminiscencijom pomoću Chemidoc MP sustava za oslikavanje.
Sve strukture korištene za analizu Solvent Accessible Surface Area (SASA) dobivene su iz Protein Data Bank (PDB)52 ili AlphaFold Protein Structure Database53.Apsolutni SASA je izračunat za svaki ostatak korištenjem FreeSASA programa.Za dobivanje srednje vrijednosti SASA za svaku strukturu korišteni su samo potpuni i nedvosmisleni SASA podaci za obilježeni histidin i njegove susjede.Relativna dostupnost otapala (RSA) za svaki histidin izračunata je dijeljenjem apsolutne SASA vrijednosti s empirijskom maksimalnom mogućom površinom ostatka dostupnom otapalu.Svi histidini su zatim klasificirani kao skriveni ako je srednja vrijednost RSA bila ispod 20%, inače su bili izloženi56.
Neobrađene datoteke dobivene u DDA modu pretražene su pomoću Proteome Discoverer (v2.5) ili MSfragger (Fragpipe v15.0) u odgovarajućoj SwissProt verificiranoj bazi podataka proteina koja sadrži uobičajene kontaminante.Peptidi su zahtijevali potpuni tripsin s dva nedostajuća mjesta cijepanja, metilaciju karbamoila kao fiksnu modifikaciju i oksidaciju metionina kao dinamičku modifikaciju.Tolerancije težine prekursora i fragmenata postavljene su na 10 ppm odnosno 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Kontaminanti su uklonjeni, a proteini su filtrirani kako bi se dobila stopa lažnih otkrića od <1%. Kontaminanti su uklonjeni, a proteini su filtrirani kako bi se dobila stopa lažnih otkrića od <1%. Popadanje zagrljajnih tvari bilo je uklonjeno, a bijeli su filtrirani, da bi se dobio koeficijent lošeg otkrivenog <1%. Kontaminanti su uklonjeni, a proteini filtrirani kako bi se dobila stopa lažne detekcije od <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Popadanja zagrljajnih tvari bila su uklonjena, a bijelci su filtrirani za postizanje razine loših otkrivenih <1%. Kontaminanti su uklonjeni, a proteini filtrirani kako bi se postigla lažno pozitivna stopa od <1%.Za kvantitativnu analizu bez uporabe oznaka korišten je normalizirani sadržaj proteina iz tri biološka ponavljanja.Analiza substanične lokalizacije proteina provedena je pomoću analize genske ontologije (GO) iz DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 i baza podataka koje je sastavila i objavila grupa Alice Ting.Karta vulkana je dobivena od Perzeja (v1.6.15.0). Promjene obilja proteina nabora su testirane na statističku značajnost pomoću dvostranog t-testa, a pogoci proteina identificirani su s promjenom obilja >2 (osim ako nije drugačije navedeno) i p vrijednošću <0,05. Promjene obilja proteina nabora su testirane na statističku značajnost pomoću dvostranog t-testa, a pogoci proteina identificirani su s promjenom obilja >2 (osim ako nije drugačije navedeno) i p vrijednošću <0,05. Promjene kratnosti sadržaja bilježnice bile su provjerene na statističku značajnost korištenjem dvostranog t-kriterija, a usklađene bilježnice identificirane su promjenom sadržaja> 2 (ako nije navedeno ino) i značenjem p <0,05. Višestruke promjene sadržaja proteina testirane su na statističku značajnost korištenjem dvosmjernog t-testa, a podudaranja proteina identificirana su s promjenom sadržaja >2 (ako nije drugačije navedeno) i ap vrijednošću <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 丰度 倍数 的 统计 显着性 ， ， 并 确定 蛋白质 命 的 丰度 变化> 2 （除非 有 说明 说明）） p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 倍 数 的 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 的 丰度> 2 （另 有）） p 值 <0,05。 Statistička značajnost kratkih promjena sadržaja bilježnice provjerena je primjenom dvostranog t-kriterija, a usklađene bilježnice su odredile promjene sadržaja >2 (ako nije navedeno isto) i p-značeno <0,05. Statistička značajnost višestrukih promjena u sadržaju proteina testirana je pomoću dvosmjernog t-testa, a podudaranja proteina određena su za promjene sadržaja >2 (ako nije drugačije naznačeno) i p-vrijednosti <0,05.Analiza interakcija proteina provedena je korištenjem GO analize zajedno s bazom podataka String.
Provedena su tri biološka ponavljanja sa sličnim rezultatima.Statistička analiza učinjena je pomoću GraphPad Prism (softver GraphPad), a grafikoni vulkana generirani su pomoću Perseusa (v1.6.15.0).Za usporedbu dviju skupina, p-vrijednosti su određene dvostranim Studentovim t-testom.Samo jednostruki proteini identificirani najmanje dva puta u eksperimentalnoj skupini uključeni su u grafikone vulkana, a odgovarajuće nedostajuće vrijednosti u kontrolnoj skupini zamijenjene su Perseusom iz normalne distribucije kako bi se mogla izračunati p-vrijednost.Stupci pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± standardna devijacija.U proteomskim analizama za statističku analizu, zadržano je obilje proteina koji su se pojavili u najmanje dva biološka ponavljanja.Za prethodno određivanje veličine uzorka nisu korištene statističke metode.Eksperimenti nisu slučajni.Istraživači nisu bili slijepi na zadatke tijekom eksperimenta i evaluacije rezultata.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak Izvješća o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci masene spektrometrije dobiveni u ovoj studiji dostavljeni su Konzorciju ProteomeXchange putem partnerskog repozitorija iProX57 pod skupom podataka ID PXD034811 (PDPL-MS skup podataka).Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.Ovaj članak daje izvorne podatke.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Upoznavanje susjedstva: korištenje biotinilacije ovisne o blizini za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Upoznavanje susjedstva: korištenje biotinilacije ovisne o blizini za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Poznavanje okoline: korištenje biotinilacije ovisne o blizini za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Razumijevanje susjedstva: iskoristite ovisnost susjedstva o biološkom životu.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Razumijevanje blizine: karakterizacija proteinskih kompleksa i mapiranje organela korištenjem biotinilacije ovisne o blizini.Trenutno.Moje mišljenje.Kemijski.biologija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB i sur.Mapiranje mikrookruženja prijenosom Dexterove energije u imunološke stanice.Znanost 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL i sur.Mreže na skali od dva proteoma detektiraju stanično-specifično preoblikovanje ljudskog interaktoma.Ćelije 184, 3022-3040.e3028 (2021).
Vrijeme objave: 15. rujna 2022
