Vijesti

Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Učinkoviti fotosenzibilizatori posebno su važni za široku kliničku primjenu fototerapije.Međutim, konvencionalni fotosenzibilizatori općenito pate od apsorpcije kratke valne duljine, nedovoljne fotostabilnosti, niskog kvantnog prinosa reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i gašenja ROS-a izazvanog agregacijom.Ovdje izvješćujemo o blisko infracrvenom (NIR) supramolekularnom fotosenzibilizatoru (RuDA) posredovanom samosastavljanjem Ru(II)-aren organometalnih kompleksa u vodenoj otopini.RuDA može generirati samo singletni kisik (1O2) u agregiranom stanju i pokazuje očito ponašanje stvaranja 1O2 izazvano agregacijom zbog značajnog povećanja u procesu križanja između singlet-tripletnog sustava.Pod djelovanjem laserskog svjetla od 808 nm, RuDA pokazuje 1O2 kvantni prinos od 16,4% (indocijaninsko zeleno odobreno od strane FDA: ΦΔ=0,2%) i visoku fototermalnu učinkovitost pretvorbe od 24,2% (komercijalne zlatne nanoštapiće) s izvrsnom fotostabilnošću.: 21,0%, zlatne nanoljuske: 13,0%).Osim toga, RuDA-NP s dobrom biokompatibilnošću mogu se prvenstveno akumulirati na mjestima tumora, uzrokujući značajnu regresiju tumora tijekom fotodinamičke terapije sa smanjenjem volumena tumora od 95,2% in vivo.Ova fotodinamička terapija za povećanje agregacije pruža strategiju za razvoj fotosenzibilizatora s povoljnim fotofizičkim i fotokemijskim svojstvima.
U usporedbi s konvencionalnom terapijom, fotodinamička terapija (PDT) je atraktivan tretman za rak zbog svojih značajnih prednosti kao što su precizna prostorno-vremenska kontrola, neinvazivnost, zanemariva otpornost na lijekove i minimiziranje nuspojava 1,2,3.Pod svjetlosnim zračenjem, korišteni fotosenzibilizatori mogu se aktivirati kako bi se formirale visoko reaktivne vrste kisika (ROS), što dovodi do apoptoze/nekroze ili imunoloških odgovora4,5. Međutim, većina konvencionalnih fotosenzibilizatora, kao što su klorini, porfirini i antrakinoni, imaju apsorpciju relativno kratke valne duljine (frekvencija < 680 nm), što rezultira slabim prodorom svjetlosti zbog intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) u vidljivo područje6,7. Međutim, većina konvencionalnih fotosenzibilizatora, kao što su klorini, porfirini i antrakinoni, imaju apsorpciju relativno kratke valne duljine (frekvencija < 680 nm), što rezultira slabim prodorom svjetlosti zbog intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) u vidljivo područje6,7. Međutim, većina običnih fotosenzibilizatora, kao što su klorin, porfirin i antrahinonija, posjeduje relativno kratkovolno poglošćenje (častota < 680 nm), što dovodi do lošeg prodiranja svijeta iz-za intenzivnog pogaženja bioloških molekula (na primjer, gemoglobina i melanina) u vidljivom području6,7. Međutim, većina uobičajenih fotosenzibilizatora kao što su klorini, porfirini i antrakinoni imaju relativno kratku apsorpciju valne duljine (< 680 nm) što rezultira slabim prodorom svjetlosti zbog intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) u vidljivom području6,7.， ， 大多数 传统 的 光敏剂 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 、 卟啉 和 蒽醌 具有 相对 较 短 的 波长 波长 频率 频率 <680 nm）） 因此 由于 对 生物 分子 （蛋白 和） 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 的 的 的 的 的 的 的 的 强烈 血红 ， 的 强烈 强烈 强烈 强烈 的 的 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 强烈 生物 生物 分子 分子 分子 分子 分子 分子 分子 （（（如导致光穿透性差。大多数 大多数 传统 传统 的 光敏剂 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， ， 具有 相对 短 的 波长 吸收 （（频率 <680 nm） 因此 由于 对 （血红 蛋白 和）） ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 和 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素））））））））））））） 吸收 吸收 吸收 吸收 ， ， ， ， 因此 由于 分子 分子 ，吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Međutim, većina tradicionalnih fotosenzibilizatora, kao što su klorin, porfirin i antrahinon, imaju relativno kratkovolno poglošćenje (častota < 680 nm) zbog jakog pogloštenja biomolekula, poput gemoglobina i melanina, što dovodi do lošeg prodiranja svijeta. Međutim, većina tradicionalnih fotosenzibilizatora kao što su klorini, porfirini i antrakinoni imaju apsorpciju relativno kratke valne duljine (frekvencija < 680 nm) zbog jake apsorpcije biomolekula kao što su hemoglobin i melanin što rezultira slabim prodorom svjetlosti.Vidljivo područje 6.7.Stoga su fotosenzibilizatori koji apsorbiraju blisko infracrveno (NIR) koji se aktiviraju u "terapijskom prozoru" od 700-900 nm vrlo prikladni za fototerapiju.Budući da biološka tkiva najmanje apsorbiraju blisko infracrveno svjetlo, ono može dovesti do dubljeg prodiranja i manjeg fotooštećenja8,9.
Nažalost, postojeći fotosenzibilizatori koji apsorbiraju NIR općenito imaju lošu fotostabilnost, nizak kapacitet generiranja singletnog kisika (1O2) i gašenje 1O2 izazvano agregacijom, što ograničava njihovu kliničku primjenu10,11.Iako su uloženi veliki napori da se poboljšaju fotofizička i fotokemijska svojstva konvencionalnih fotosenzibilizatora, do sada je nekoliko izvješća objavilo da fotosenzibilizatori koji apsorbiraju NIR mogu riješiti sve te probleme.Osim toga, nekoliko fotosenzibilizatora obećava učinkovito stvaranje 1O212,13,14 kada se ozrači svjetlom iznad 800 nm, budući da energija fotona brzo opada u bliskom IR području.Trifenilamin (TFA) kao donor elektrona i [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazin (TDP) kao grupa akceptora elektrona Klasa boja tipa donor-akceptor (DA) boja , apsorbirajući blisko infracrveno zračenje, koje su opsežno proučavane za bioimaging II bliskog infracrvenog zračenja i fototermalnu terapiju (PTT) zbog svog uskog pojasnog pojasa.Stoga se boje tipa DA mogu koristiti za PDT s ekscitacijom u bliskom IR-u, iako su rijetko proučavane kao fotosenzibilizatori za PDT.
Dobro je poznato da visoka učinkovitost intersistemskog križanja (ISC) fotosenzibilizatora potiče stvaranje 1O2.Uobičajena strategija za unapređenje ISC procesa je pojačati spin-orbit spregu (SOC) fotosenzibilizatora uvođenjem teških atoma ili posebnih organskih ostataka.Međutim, ovaj pristup još uvijek ima neke nedostatke i ograničenja19,20.Nedavno je supramolekularno samosastavljanje omogućilo inteligentan pristup odozdo prema gore za izradu funkcionalnih materijala na molekularnoj razini,21,22 s brojnim prednostima u fototerapiji: (1) samosastavljeni fotosenzibilizatori mogu imati potencijal za stvaranje vrpčastih struktura.Slično elektroničkim strukturama s gušćom raspodjelom energetskih razina zbog preklapanja orbita između građevnih blokova.Stoga će se poboljšati energetsko podudaranje između nižeg singletnog pobuđenog stanja (S1) i susjednog tripletnog pobuđenog stanja (Tn), što je korisno za ISC proces 23, 24 .(2) Supramolekularno sklapanje smanjit će neradijacijsko opuštanje temeljeno na mehanizmu ograničenja intramolekularnog gibanja (RIM), koji također potiče ISC proces 25, 26.(3) Supramolekularni sklop može zaštititi unutarnje molekule monomera od oksidacije i razgradnje, čime se značajno poboljšava fotostabilnost fotosenzibilizatora.S obzirom na gore navedene prednosti, vjerujemo da supramolekularni fotosenzibilizacijski sustavi mogu biti obećavajuća alternativa za prevladavanje nedostataka PDT-a.
Kompleksi na bazi Ru(II) obećavajuća su medicinska platforma za potencijalne primjene u dijagnostici i terapiji bolesti zbog svojih jedinstvenih i atraktivnih bioloških svojstava28,29,30,31,32,33,34.Osim toga, obilje pobuđenih stanja i podesiva fotofizičko-kemijska svojstva kompleksa na bazi Ru(II) pružaju velike prednosti za razvoj fotosenzibilizatora na bazi Ru(II)35,36,37,38,39,40.Značajan primjer je rutenij(II) polipiridil kompleks TLD-1433, koji je trenutno u fazi II kliničkih ispitivanja kao fotosenzibilizator za liječenje nemišićno invazivnog raka mokraćnog mjehura (NMIBC)41.Osim toga, organometalni kompleksi rutenij(II)arena naširoko se koriste kao kemoterapijski agensi za liječenje raka zbog svoje niske toksičnosti i lakoće modifikacije42,43,44,45.Ionska svojstva Ru(II)-aren organometalnih kompleksa mogu ne samo poboljšati slabu topljivost DA kromofora u uobičajenim otapalima, već također poboljšati sastavljanje DA kromofora.Osim toga, pseudooktaedarska polusendvič struktura organometalnih kompleksa Ru(II)-arena može sterički spriječiti H-agregaciju kromofora tipa DA, čime se olakšava stvaranje J-agregacije s crveno pomaknutim apsorpcijskim vrpcama.Međutim, inherentni nedostaci Ru(II)-aren kompleksa, kao što je niska stabilnost i/ili slaba bioraspoloživost, mogu utjecati na terapijsku učinkovitost i in vivo aktivnost aren-Ru(II) kompleksa.Međutim, studije su pokazale da se ti nedostaci mogu prevladati inkapsulacijom rutenijevih kompleksa s biokompatibilnim polimerima fizičkom inkapsulacijom ili kovalentnom konjugacijom.
U ovom radu izvješćujemo o DA-konjugiranim kompleksima Ru(II)-arena (RuDA) s NIR okidačem preko koordinacijske veze između DAD kromofora i Ru(II)-arenskog dijela.Nastali kompleksi mogu se sami okupiti u metalosupramolekularne vezikule u vodi zbog nekovalentnih interakcija.Naime, supramolekularni sklop je RuDA-i dao svojstva međusistemskog križanja izazvana polimerizacijom, što je značajno povećalo učinkovitost ISC, što je bilo vrlo povoljno za PDT (Slika 1A).Kako bi se povećala akumulacija tumora i in vivo biokompatibilnost, Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) odobren od strane FDA korišten je za kapsuliranje RuDA47,48,49 za stvaranje RuDA-NP nanočestica (Slika 1B) koje su djelovale kao vrlo učinkovit PDT/Dual- način PTT proxy .U fototerapiji raka (Slika 1C), RuDA-NP je korišten za liječenje golih miševa s MDA-MB-231 tumorima za proučavanje učinkovitosti PDT i PTT in vivo.
Shematski prikaz fotofizičkog mehanizma RuDA u monomernom i agregiranom obliku za fototerapiju raka, sinteza B RuDA-NP i C RuDA-NP za NIR-aktivirani PDT i PTT.
RuDA, koja se sastoji od TPA i TDP funkcionalnosti, pripremljena je u skladu s postupkom prikazanim na Dodatnoj slici 1 (Slika 2A), a RuDA je karakterizirana 1H i 13C NMR spektrom, elektrosprej ionizacijskom masenom spektrometrijom i elementarnom analizom (Dodatne slike 2-4 ).RuDA mapa razlike gustoće elektrona najnižeg singletnog prijelaza izračunata je pomoću teorije funkcionalne gustoće ovisne o vremenu (TD-DFT) za proučavanje procesa prijenosa naboja.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 5, gustoća elektrona se uglavnom kreće od trifenilamina do akceptorske jedinice TDP nakon fotoekscitacije, što se može pripisati tipičnom prijelazu unutarmolekularnog prijenosa naboja (CT).
Kemijska struktura rude. B Apsorpcijski spektri rude u smjesama različitih omjera DMF-a i vode.C Normalizirane vrijednosti apsorpcije RuDA (800 nm) i ICG (779 nm) u odnosu na vrijeme pri 0,5 W cm-2 laserskog svjetla od 808 nm.D Na fotodegradaciju ABDA ukazuje RuDA-induciran nastanak 1O2 u smjesama DMF/H2O s različitim sadržajem vode pod djelovanjem laserskog zračenja valne duljine 808 nm i snage 0,5 W/cm2.
Sažetak—UV-vidljiva apsorpcijska spektroskopija korištena je za proučavanje svojstava samosklapanja rude u mješavinama DMF-a i vode u različitim omjerima.Kao što je prikazano na sl.Na slici 2B, RuDA pokazuje apsorpcijske trake od 600 do 900 nm u DMF-u s maksimalnom apsorpcijskom trakom na 729 nm.Povećanje količine vode dovelo je do postupnog crvenog pomaka maksimuma apsorpcije rude na 800 nm, što ukazuje na J-agregaciju rude u sastavljenom sustavu.Spektri fotoluminiscencije RuDA u različitim otapalima prikazani su na dodatnoj slici 6. Čini se da RuDA pokazuje tipičnu NIR-II luminiscenciju s maksimalnom valnom duljinom emisije od ca.1050 nm u CH2Cl2 odnosno CH3OH.Veliki Stokesov pomak (oko 300 nm) RuDA ukazuje na značajnu promjenu u geometriji pobuđenog stanja i formiranje niskoenergetskih pobuđenih stanja.Kvantni prinosi luminiscencije rude u CH2Cl2 i CH3OH su određeni na 3,3 odnosno 0,6%.Međutim, u mješavini metanola i vode (5/95, v/v), primijećen je lagani crveni pomak emisije i smanjenje kvantnog prinosa (0,22%), što može biti posljedica samookupljanja rude .
Kako bismo vizualizirali samosastavljanje ORE-a, upotrijebili smo tekuću mikroskopiju atomske sile (AFM) za vizualizaciju morfoloških promjena u ORE-u u otopini metanola nakon dodavanja vode.Kad je sadržaj vode bio ispod 80%, nije primijećena jasna agregacija (dodatna slika 7).Međutim, s daljnjim povećanjem udjela vode na 90-95%, pojavile su se male nanočestice, koje su upućivale na samo-sastavljanje Ore. Osim toga, lasersko zračenje valne duljine od 808 nm nije utjecalo na intenzitet apsorpcije RuDA u vodenoj rješenje (slika 2C i dopunska slika 8).Nasuprot tome, apsorbancija indocijanin zelenog (ICG kao kontrola) brzo je pala na 779 nm, što ukazuje na izvrsnu fotostabilnost RuDA.Osim toga, stabilnost RuDA-NP u PBS (pH = 5,4, 7,4 i 9,0), 10% FBS i DMEM (visoka glukoza) ispitana je UV-vidljivom apsorpcijskom spektroskopijom u različitim vremenskim točkama.Kao što je prikazano na dodatnoj slici 9, male promjene u RuDA-NP apsorpcijskim vrpcama primijećene su u PBS-u pri pH 7,4/9,0, FBS-u i DMEM-u, što ukazuje na izvrsnu stabilnost RuDA-NP-a.Međutim, u kiseloj sredini (rN = 5,4) utvrđena je hidroliza rude.Također smo dodatno procijenili stabilnost RuDA i RuDA-NP koristeći metode tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC).Kao što je prikazano na dodatnoj slici 10, RuDA je bio stabilan u smjesi metanola i vode (50/50, v/v) tijekom prvog sata, a hidroliza je uočena nakon 4 sata.Međutim, primijećen je samo široki konkavno-konveksni vrh za RuDA NP.Stoga je gel permeacijska kromatografija (GPC) korištena za procjenu stabilnosti RuDA NP u PBS (pH = 7,4).Kao što je prikazano na dodatnoj slici 11, nakon 8 sati inkubacije u testiranim uvjetima, visina vrha, širina vrha i površina vrha NP RuDA nisu se značajno promijenile, što ukazuje na izvrsnu stabilnost NP RuDA.Osim toga, TEM slike su pokazale da je morfologija nanočestica RuDA-NP ostala gotovo nepromijenjena nakon 24 sata u razrijeđenom PBS puferu (pH = 7,4, Dodatna slika 12).
Budući da samosastavljanje može dati različite funkcionalne i kemijske karakteristike rudi, uočili smo oslobađanje 9,10-antracendiilbis(metilen)dimalonske kiseline (ABDA, indikator 1O2) u smjesama metanola i vode.Ruda s različitim sadržajem vode50.Kao što je prikazano na slici 2D i dodatnoj slici 13, nije primijećena degradacija ABDA kada je sadržaj vode bio ispod 20%.S povećanjem vlažnosti na 40% došlo je do degradacije ABDA, što je vidljivo smanjenjem intenziteta fluorescencije ABDA.Također je primijećeno da veći sadržaj vode rezultira bržom razgradnjom, što sugerira da je samosastavljanje RuDA neophodno i korisno za razgradnju ABDA.Ovaj fenomen se jako razlikuje od modernih kromofora ACQ (gašenje inducirano agregacijom).Kada se ozrači laserom valne duljine od 808 nm, kvantni prinos 1O2 RuDA u smjesi 98% H2O/2% DMF je 16,4%, što je 82 puta više od ICG (ΦΔ = 0,2%)51, pokazujući izvanrednu učinkovitost proizvodnje 1O2 RuDA u agregatnom stanju.
Elektronski vrtnje pomoću 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) i 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksida (DMPO) kao spinskih zamki Rezonantna spektroskopija (ESR) korištena je za identifikaciju dobivenih vrsta AFK.od RuDA.Kao što je prikazano na dodatnoj slici 14, potvrđeno je da se 1O2 stvara u vremenima zračenja između 0 i 4 minute.Osim toga, kada je RuDA inkubirana s DMPO pod zračenjem, detektiran je tipični četveroredni EPR signal 1:2:2:1 DMPO-OH· adukta, što ukazuje na stvaranje hidroksilnih radikala (OH·).Sveukupno, gornji rezultati pokazuju sposobnost RuDA da stimulira proizvodnju ROS kroz dvostruki proces fotosenzibilizacije tipa I/II.
Kako bi se bolje razumjela elektronska svojstva RuDA u monomernim i agregiranim oblicima, granične molekularne orbitale RuDA u monomernim i dimernim oblicima izračunate su pomoću DFT metode.Kao što je prikazano na sl.Na slici 3A, najviša zauzeta molekularna orbitala (HOMO) monomerne RuDA je delokalizirana duž okosnice liganda, a najniža nezauzeta molekularna orbitala (LUMO) je usredotočena na TDP akceptorsku jedinicu.Naprotiv, gustoća elektrona u dimernom HOMO koncentrirana je na ligandu jedne molekule RuDA, dok je gustoća elektrona u LUMO uglavnom koncentrirana na akceptorskoj jedinici druge molekule RuDA, što ukazuje da je RuDA u dimeru.Značajke CT-a.
A HOMO i LUMO rude izračunavaju se u monomernim i dimernim oblicima.B Singletne i tripletne energetske razine Orea u monomerima i dimerima.C Procijenjene razine RuDA i mogućih ISC kanala kao monomernih C i dimernih D. Strelice pokazuju moguće ISC kanale.
Distribucija elektrona i šupljina u niskoenergetskim singletnim pobuđenim stanjima RuDA u monomernom i dimernom obliku analizirana je pomoću softvera Multiwfn 3.852.53, koji su izračunati pomoću TD-DFT metode.Kako je naznačeno na dodatnoj etiketi.Kao što je prikazano na slikama 1-2, monomerne RDA rupe uglavnom su delokalizirane duž okosnice liganda u ovim singletno pobuđenim stanjima, dok su elektroni uglavnom smješteni u TDP skupini, pokazujući intramolekularne karakteristike CT-a.Osim toga, za ova singletno pobuđena stanja, postoji više ili manje preklapanja između šupljina i elektrona, što sugerira da ta singletno pobuđena stanja daju određeni doprinos lokalnoj ekscitaciji (LE).Za dimere, uz intramolekularne CT i LE značajke, primijećen je određeni udio intermolekularnih CT značajki u odgovarajućim stanjima, posebno S3, S4, S7 i S8, na temelju intermolekularne CT analize, s CT međumolekularnim prijelazima kao glavnim. (Dodatna tablica).3).
Kako bismo bolje razumjeli eksperimentalne rezultate, dodatno smo istražili svojstva RuDA pobuđenih stanja kako bismo istražili razlike između monomera i dimera (dodatne tablice 4-5).Kao što je prikazano na slici 3B, energetske razine singletnih i tripletnih pobuđenih stanja dimera mnogo su gušće od onih monomera, što pomaže smanjiti energetski jaz između S1 i Tn. Objavljeno je da se ISC prijelazi mogu ostvariti unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54. Objavljeno je da se ISC prijelazi mogu ostvariti unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54. Priopćeno je da se ISC prijelazi mogu realizirati u malom području energetske energije (ΔES1-Tn <0,3 éV) između S1 i Tn54. Objavljeno je da se ISC prijelazi mogu realizirati unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn <0,3 eV) između S1 i Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Priopćeno je da se prijelaz ISC može realizirati u području malih energetskih ćelija (ΔES1-Tn < 0,3 éV) između S1 i Tn54. Objavljeno je da se ISC prijelaz može ostvariti unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54.Osim toga, samo jedna orbitala, zauzeta ili nezauzeta, mora se razlikovati u vezanim singletnim i tripletnim stanjima da bi se dobio SOC integral različit od nule.Dakle, na temelju analize energije pobude i orbitalnog prijelaza, svi mogući kanali ISC prijelaza prikazani su na sl.3C,D.Naime, u monomeru je dostupan samo jedan ISC kanal, dok dimerni oblik ima četiri ISC kanala koji mogu poboljšati ISC prijelaz.Stoga je razumno pretpostaviti da što je više RuDA molekula agregirano, to će ISC kanali biti pristupačniji.Stoga RuDA agregati mogu formirati dvopojasne elektroničke strukture u singletnom i tripletnom stanju, smanjujući energetski jaz između S1 i dostupnog Tn, čime se povećava učinkovitost ISC-a kako bi se olakšalo stvaranje 1O2.
Kako bismo dodatno razjasnili temeljni mehanizam, sintetizirali smo referentni spoj arene-Ru(II) kompleksa (RuET) zamjenom dviju etilnih skupina s dvije trifenilaminske fenilne skupine u RuDA (Slika 4A, za potpunu karakterizaciju pogledajte ESI, Dopunski 15 -21 ) Od donora (dietilamin) do akceptora (TDF), RuET ima iste intramolekularne CT karakteristike kao RuDA.Kao što se i očekivalo, apsorpcijski spektar RuET-a u DMF-u pokazao je traku prijenosa naboja niske energije s jakom apsorpcijom u bliskom infracrvenom području u području od 600-1100 nm (Sl. 4B).Osim toga, agregacija RuET-a također je primijećena s povećanjem sadržaja vode, što se odrazilo na crveni pomak apsorpcijskog maksimuma, što je dodatno potvrđeno tekućim AFM snimanjem (dopunska slika 22).Rezultati pokazuju da RuET, poput RuDA, može formirati intramolekularna stanja i samosastaviti se u agregirane strukture.
Kemijska struktura RuET-a.B Apsorpcijski spektri RuET-a u smjesama različitih omjera DMF-a i vode.Parcele C EIS Nyquist za RuDA i RuET.Fotostrujni odziv D RuDA i RuET pod djelovanjem laserskog zračenja valne duljine 808 nm.
Fotodegradacija ABDA u prisutnosti RuET-a procijenjena je zračenjem laserom valne duljine od 808 nm.Iznenađujuće, nije primijećena degradacija ABDA u različitim frakcijama vode (dodatna slika 23).Mogući razlog je taj što RuET ne može učinkovito formirati vrpčastu elektroničku strukturu jer etilni lanac ne potiče učinkovit međumolekularni prijenos naboja.Stoga su provedena elektrokemijska impedancijska spektroskopija (EIS) i prijelazna fotostrujna mjerenja kako bi se usporedila fotoelektrokemijska svojstva RuDA i RuET.Prema Nyquistovom dijagramu (slika 4C), RuDA pokazuje puno manji radijus od RuET-a, što znači da RuDA56 ima brži međumolekularni transport elektrona i bolju vodljivost.Osim toga, gustoća fotostruje RuDA je puno veća nego RuET (Sl. 4D), što potvrđuje bolju učinkovitost prijenosa naboja RuDA57.Stoga fenilna skupina trifenilamina u Oreu igra važnu ulogu u osiguravanju međumolekularnog prijenosa naboja i formiranju vrpčaste elektronske strukture.
Kako bismo povećali nakupljanje tumora i in vivo biokompatibilnost, dodatno smo inkapsulirali RuDA s F127.Utvrđeno je da prosječni hidrodinamički promjer RuDA-NP iznosi 123,1 nm s uskom distribucijom (PDI = 0,089) pomoću metode dinamičkog raspršenja svjetlosti (DLS) (Slika 5A), koja je pospješila nakupljanje tumora povećanjem propusnosti i zadržavanja.EPR) učinak.TEM slike su pokazale da Ore NP imaju ujednačen sferni oblik s prosječnim promjerom od 86 nm.Značajno, apsorpcijski maksimum RuDA-NP pojavio se na 800 nm (dodatna slika 24), što ukazuje da RuDA-NP mogu zadržati funkcije i svojstva RuDA koji se sami sastavljaju.Izračunati kvantni prinos ROS za NP Ore je 15,9%, što je usporedivo s Oreom. Fototermalna svojstva RuDA NP proučavana su pod djelovanjem laserskog zračenja valne duljine od 808 nm pomoću infracrvene kamere.Kao što je prikazano na sl.5B,C, kontrolna skupina (samo PBS) doživjela je blagi porast temperature, dok je temperatura otopine RuDA-NPs brzo porasla s povećanjem temperature (ΔT) na 15,5, 26,1 i 43,0°C.Visoke koncentracije bile su 25, 50, odnosno 100 µM, što ukazuje na snažan fototermalni učinak RuDA NP.Osim toga, provedena su mjerenja ciklusa grijanja/hlađenja kako bi se procijenila fototermalna stabilnost RuDA-NP i usporedila s ICG.Temperatura Ore NP nije se smanjila nakon pet ciklusa zagrijavanja/hlađenja (slika 5D), što ukazuje na izvrsnu fototermalnu stabilnost Ore NP.Nasuprot tome, ICG pokazuje nižu fototermalnu stabilnost kao što se vidi iz očitog nestanka fototermalnog temperaturnog platoa pod istim uvjetima.Prema prethodnoj metodi58, učinkovitost fototermalne pretvorbe (PCE) RuDA-NP izračunata je na 24,2%, što je više od postojećih fototermalnih materijala kao što su zlatne nanošipke (21,0%) i zlatne nanoljuske (13,0%)59.Stoga NP Ore pokazuju izvrsna fototermalna svojstva, što ih čini obećavajućim PTT agensima.
Analiza DLS i TEM slika RuDA NP (umetnuti).B Toplinske slike različitih koncentracija RuDA NPs izloženih laserskom zračenju na valnoj duljini od 808 nm (0,5 W cm-2).C Krivulje fototermalne pretvorbe različitih koncentracija NP rude, koje su kvantitativni podaci.B. D Povećanje temperature ORE NP i ICG tijekom 5 ciklusa grijanje-hlađenje.
Fotocitotoksičnost RuDA NP-a protiv MDA-MB-231 ljudskih stanica raka dojke procijenjena je in vitro.Kao što je prikazano na sl.Na slikama 6A, B, RuDA-NP i RuDA pokazali su zanemarivu citotoksičnost u odsutnosti zračenja, što ukazuje na manju tamnu toksičnost RuDA-NP i RuDA.Međutim, nakon izlaganja laserskom zračenju na valnoj duljini od 808 nm, RuDA i RuDA NPs pokazali su snažnu fotocitotoksičnost protiv stanica raka MDA-MB-231 s IC50 vrijednostima (polovična maksimalna inhibitorna koncentracija) od 5,4 odnosno 9,4 μM, pokazujući da RuDA-NP i RuDA imaju potencijal za fototerapiju raka.Osim toga, fotocitotoksičnost RuDA-NP i RuDA dodatno je istražena u prisutnosti vitamina C (Vc), ROS čistača, kako bi se razjasnila uloga ROS u svjetlom induciranoj citotoksičnosti.Očito je da se vijabilnost stanica povećala nakon dodatka Vc, a IC50 vrijednosti RuDA i RuDA NPs bile su 25,7 odnosno 40,0 μM, što dokazuje važnu ulogu ROS u fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA NPs.Svjetlom izazvana citotoksičnost RuDA-NP i RuDA u stanicama raka MDA-MB-231 bojenjem živih/mrtvih stanica upotrebom kalceina AM (zelena fluorescencija za žive stanice) i propidijevog jodida (PI, crvena fluorescencija za mrtve stanice).potvrđuju stanice) kao fluorescentne sonde.Kao što je prikazano na slici 6C, stanice tretirane s RuDA-NP ili RuDA ostale su održive bez zračenja, što je dokazano intenzivnom zelenom fluorescencijom.Naprotiv, pod laserskim zračenjem uočena je samo crvena fluorescencija, što potvrđuje učinkovitu fotocitotoksičnost RuDA ili RuDA NP.Važno je napomenuti da se zelena fluorescencija pojavila nakon dodatka Vc, što ukazuje na kršenje fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA NP.Ovi su rezultati u skladu s in vitro testovima fotocitotoksičnosti.
Viabilnost ovisna o dozi A RuDA- i B RuDA-NP stanica u MDA-MB-231 stanicama u prisutnosti ili odsutnosti Vc (0,5 mM), redom.Stupci pogrešaka, srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparni dvostrani t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparni dvostrani t-test *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.C Analiza bojenja živih/mrtvih stanica korištenjem kalceina AM i propidijevog jodida kao fluorescentnih sondi.Mjerna traka: 30 µm.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake skupine.D Konfokalne fluorescentne slike proizvodnje ROS u stanicama MDA-MB-231 pod različitim uvjetima liječenja.Zelena DCF fluorescencija ukazuje na prisutnost ROS.Zračiti laserom valne duljine 808 nm sa snagom od 0,5 W/cm2 10 minuta (300 J/cm2).Mjerna traka: 30 µm.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake skupine.E Protočna citometrija RuDA-NPs (50 µM) ili RuDA (50 µM) analiza tretmana sa ili bez 808 nm lasera (0,5 W cm-2) u prisutnosti i odsutnosti Vc (0,5 mM) tijekom 10 minuta.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake skupine.F Nrf-2, HSP70 i HO-1 stanica MDA-MB-231 tretiranih s RuDA-NP (50 µM) sa ili bez laserskog zračenja od 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), stanice izražavaju 2).Prikazane su reprezentativne slike dva biološka ponavljanja iz svake skupine.
Intracelularna proizvodnja ROS-a u stanicama MDA-MB-231 ispitana je metodom bojenja 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetatom (DCFH-DA).Kao što je prikazano na sl.Na slici 6D, stanice tretirane s RuDA-NP ili RuDA pokazale su izrazitu zelenu fluorescenciju kada su ozračene laserom od 808 nm, što ukazuje da RuDA-NP i RuDA imaju učinkovitu sposobnost generiranja ROS.Naprotiv, u nedostatku svjetla ili u prisutnosti Vc, primijećen je samo slab fluorescentni signal stanica, što je upućivalo na lagano stvaranje ROS.Intracelularne razine ROS-a u stanicama RuDA-NP i stanicama MDA-MB-231 tretiranim s RuDA-om dalje su određene protočnom citometrijom.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 25, srednji intenzitet fluorescencije (MFI) koji generiraju RuDA-NP i RuDA pod laserskim zračenjem od 808 nm značajno je povećan za oko 5,1 odnosno 4,8 puta, u usporedbi s kontrolnom skupinom, potvrđujući njihovu izvrsnu formaciju AFK.kapacitet.Međutim, unutarstanične razine ROS-a u stanicama RuDA-NP ili MDA-MB-231 tretiranim s RuDA bile su usporedive samo s kontrolama bez laserskog zračenja ili u prisutnosti Vc, slično rezultatima analize konfokalne fluorescencije.
Pokazalo se da su mitohondriji glavna meta Ru(II)-aren kompleksa60.Stoga je istražena subcelularna lokalizacija RuDA i RuDA-NP.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 26, RuDA i RuDA-NP pokazuju slične profile stanične distribucije s najvećim nakupljanjem u mitohondrijima (62,5 ± 4,3 odnosno 60,4 ± 3,6 ng/mg proteina).Međutim, samo je mala količina Ru pronađena u nuklearnim frakcijama Ore i NP Ore (3,5 odnosno 2,1%).Preostala stanična frakcija sadržavala je rezidualni rutenij: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg proteina) za RuDA i 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg proteina) za RuDA-NP.Općenito, Ore i NP Ore se uglavnom nakupljaju u mitohondrijima.Za procjenu mitohondrijske disfunkcije upotrijebili smo bojenje JC-1 i MitoSOX Red za procjenu potencijala mitohondrijske membrane i kapaciteta proizvodnje superoksida.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 27, primijećena je intenzivna zelena (JC-1) i crvena (MitoSOX Red) fluorescencija u stanicama tretiranim i RuDA i RuDA-NP pod laserskim zračenjem od 808 nm, što ukazuje da su i RuDA i RuDA-NP visoko fluorescentni Može učinkovito potaknuti depolarizaciju mitohondrijske membrane i proizvodnju superoksida.Uz to, mehanizam stanične smrti određen je pomoću analize aneksina V-FITC/propidijevog jodida (PI) temeljene na protočnoj citometriji.Kao što je prikazano na slici 6E, kada su ozračeni laserom od 808 nm, RuDA i RuDA-NP inducirali su značajno povećanu stopu rane apoptoze (donji desni kvadrant) u stanicama MDA-MB-231 u usporedbi s PBS ili PBS plus laserom.obrađene stanice.Međutim, kada je dodan Vc, stopa apoptoze RuDA i RuDA-NP značajno se smanjila s 50,9% i 52,0% na 15,8% odnosno 17,8%, što potvrđuje važnu ulogu ROS-a u fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA-NP..Osim toga, uočene su blage nekrotične stanice u svim testiranim skupinama (gornji lijevi kvadrant), što sugerira da bi apoptoza mogla biti dominantan oblik stanične smrti izazvan RuDA i RuDA-NP.
Budući da je oštećenje izazvano oksidativnim stresom glavna determinanta apoptoze, nuklearni faktor povezan s eritroidom 2, faktor 2 (Nrf2) 62, ključnim regulatorom antioksidativnog sustava, istražen je u MDA-MB-231 tretiranom s RuDA-NPs.Mehanizam djelovanja RuDA NP induciran zračenjem.U isto vrijeme, također je otkrivena ekspresija nizvodnog proteina heme oksigenaze 1 (HO-1).Kao što je prikazano na slici 6F i dodatnoj slici 29, fototerapija posredovana RuDA-NP povećala je razine ekspresije Nrf2 i HO-1 u usporedbi s PBS grupom, što ukazuje da RuDA-NP mogu stimulirati signalne puteve oksidativnog stresa.Osim toga, za proučavanje fototermalnog učinka RuDA-NPs63, također je procijenjena ekspresija proteina toplinskog šoka Hsp70.Jasno je da su stanice tretirane s RuDA-NPs + 808 nm laserskim zračenjem pokazale povećanu ekspresiju Hsp70 u usporedbi s druge dvije skupine, odražavajući stanični odgovor na hipertermiju.
Izvanredni rezultati in vitro potaknuli su nas da istražimo učinak RuDA-NP in vivo u golih miševa s tumorima MDA-MB-231.Tkivna distribucija RuDA NP proučavana je određivanjem sadržaja rutenija u jetri, srcu, slezeni, bubrezima, plućima i tumorima.Kao što je prikazano na sl.Na slici 7A, maksimalni sadržaj Ore NP u normalnim organima pojavio se u prvom vremenu promatranja (4 h), dok je maksimalni sadržaj određen u tumorskim tkivima 8 sati nakon injekcije, vjerojatno zbog Ore NP.EPR učinak LF.Prema rezultatima raspodjele, optimalno trajanje tretmana NP oreom je 8 sati nakon primjene.Kako bi se ilustrirao proces nakupljanja RuDA-NP na mjestima tumora, fotoakustična (PA) svojstva RuDA-NP praćena su snimanjem PA signala RuDA-NP u različitim vremenima nakon injekcije.Prvo, PA signal RuDA-NP in vivo procijenjen je snimanjem PA slika mjesta tumora nakon intratumoralne injekcije RuDA-NP.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 30, RuDA-NP-ovi su pokazali jak PA signal, a postojala je pozitivna korelacija između koncentracije RuDA-NP i intenziteta PA signala (Dopunska slika 30A).Zatim su in vivo PA slike mjesta tumora snimljene nakon intravenske injekcije RuDA i RuDA-NP u različitim vremenskim točkama nakon injekcije.Kao što je prikazano na slici 7B, PA signal RuDA-NPs iz mjesta tumora postupno je rastao s vremenom i dosegao plato 8 sati nakon injekcije, u skladu s rezultatima distribucije u tkivu određenim ICP-MS analizom.S obzirom na RuDA (dodatna slika 30B), maksimalni intenzitet PA signala pojavio se 4 sata nakon injekcije, što ukazuje na brzu stopu ulaska RuDA u tumor.Osim toga, istraženo je ponašanje RuDA i RuDA-NP pri izlučivanju određivanjem količine rutenija u urinu i fecesu pomoću ICP-MS.Glavni put eliminacije za RuDA (dodatna slika 31) i RuDA-NP (slika 7C) je putem fecesa, a učinkovito uklanjanje RuDA i RuDA-NP primijećeno je tijekom 8-dnevnog razdoblja ispitivanja, što znači da je RuDA i RuDA-NP mogu se učinkovito eliminirati iz tijela bez dugotrajne toksičnosti.
A. Ex vivo distribucija RuDA-NP u tkivima miševa određena je sadržajem Ru (postotak primijenjene doze Ru (ID) po gramu tkiva) u različitim vremenima nakon injekcije.Podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparni dvostrani t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparni dvostrani t-test *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.BPA slike in vivo mjesta tumora pri ekscitaciji od 808 nm nakon intravenske primjene RuDA-NP (10 µmol kg-1) u različitim vremenskim točkama.Nakon intravenske primjene RuDA NP (10 µmol kg-1), C Ru je izlučen iz miševa urinom i fecesom u različitim vremenskim intervalima.Podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3).
Kapacitet zagrijavanja RuDA-NP in vivo proučavan je na golim miševima s MDA-MB-231 i RuDA tumorima za usporedbu.Kao što je prikazano na sl.8A i dodatnoj slici 32, kontrolna (slana) skupina pokazala je manju promjenu temperature (ΔT ≈ 3 °C) nakon 10 minuta kontinuiranog izlaganja.Međutim, temperatura RuDA-NP i RuDA brzo se povećala s maksimalnim temperaturama od 55,2 odnosno 49,9 °C, pružajući dovoljnu hipertermiju za in vivo terapiju raka.Uočeno povećanje visoke temperature za RuDA NP (ΔT ≈ 24°C) u usporedbi s RuDA (ΔT ≈ 19°C) može biti posljedica njegove bolje propusnosti i nakupljanja u tumorskim tkivima zbog EPR učinka.
Infracrvene toplinske slike miševa s MDA-MB-231 tumorima ozračenih 808 nm laserom u različitim vremenima 8 sati nakon injekcije.Prikazane su reprezentativne slike četiri biološka ponavljanja iz svake skupine.B Relativni volumen tumora i C Prosječna masa tumora različitih skupina miševa tijekom liječenja.D Krivulje tjelesne težine različitih skupina miševa.Zračiti laserom valne duljine 808 nm sa snagom od 0,5 W/cm2 10 minuta (300 J/cm2).Stupci pogrešaka, srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Nespareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparni dvostrani t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparni dvostrani t-test *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Nespareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001. E H&E slike bojenja glavnih organa i tumora iz različitih skupina liječenja, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laserske skupine. E H&E slike bojenja glavnih organa i tumora iz različitih skupina liječenja, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laserske skupine. Slike okrašivanja E H&E osnovnih i opuholej organa iz različitih grupa liječenja, uključujući grupe fizioloških otopina, fizioloških otopina + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser. E H&E slike bojenja glavnih organa i tumora iz različitih skupina liječenja, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laserske skupine.来自 不同 治疗 组 的 的 主要 器官 和 肿瘤 的 的 e h & e 染色 图像 ， ， 包括 、 盐 水 + 激光 、 、 、 、 、 ruda 、 Ruda + 激光 、 、 、 、 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Okrašivanje E H&E glavnih organa i opuholeja iz različitih grupa tretmana, uključujući fiziološki rastvor, fiziološki rastvor + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser. E H&E bojenje glavnih organa i tumora iz različitih skupina liječenja uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser.Mjerna traka: 60 µm.
Procijenjen je učinak fototerapije in vivo s RuDA i RuDA NPs u kojima su golim miševima s MDA-MB-231 tumorima intravenozno ubrizgane RuDA ili RuDA NPs u jednoj dozi od 10,0 µmol kg-1 putem repne vene, a zatim 8 sati nakon injekcije.lasersko zračenje valne duljine 808 nm.Kao što je prikazano na slici 8B, volumeni tumora bili su značajno povećani u skupinama liječenim fiziološkom otopinom i laserom, što ukazuje da je zračenje fiziološkom otopinom ili laserom 808 imalo mali učinak na rast tumora.Kao iu skupini koja je primala fiziološku otopinu, brzi rast tumora također je primijećen kod miševa tretiranih s RuDA-NP ili RuDA u odsutnosti laserskog zračenja, što pokazuje njihovu nisku toksičnost u tami.Nasuprot tome, nakon laserskog zračenja, i tretman RuDA-NP i RuDA inducirao je značajnu regresiju tumora sa smanjenjem volumena tumora od 95,2% odnosno 84,3%, u usporedbi sa skupinom liječenom fiziološkom otopinom, što ukazuje na odličan sinergistički PDT., posredovan efektom RuDA/CHTV.– NP ili Ore. U usporedbi s RuDA-om, RuDA NP-ovi su pokazali bolji fototerapijski učinak, koji je uglavnom bio posljedica EPR učinka RuDA NP-ova.Rezultati inhibicije rasta tumora dodatno su procijenjeni težinom tumora izrezanog 15. dana liječenja (Slika 8C i Dodatna slika 33).Prosječna masa tumora u miševa tretiranih s RuDA-NP i miševa tretiranih s RuDA bila je 0,08 odnosno 0,27 g, što je bilo puno manje nego u kontrolnoj skupini (1,43 g).
Osim toga, svaka tri dana bilježena je tjelesna težina miševa kako bi se proučavala toksičnost RuDA-NP ili RuDA in vivo u tami.Kao što je prikazano na slici 8D, nisu primijećene značajne razlike u tjelesnoj težini za sve tretirane skupine. Nadalje, poduzeto je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubreg) iz različitih skupina za liječenje. Nadalje, obavljeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubreg) iz različitih liječenih skupina. Osim toga, provedeno je skraćivanje gematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srca, pečenja, selezenki, lakih i poček) iz liječenja različitih grupa. Osim toga, izvršeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi) iz različitih skupina koje su tretirane.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (ON) Osim toga, provodili smo skraćivanje gematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srca, pečenja, selezenki, lakih i boda) u različitim skupinama liječenja. Osim toga, bojenje glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubreg) hematoksilinom i eozinom (H&E) provedeno je u različitim terapijskim skupinama.Kao što je prikazano na sl.8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz RuDA-NP i RuDA grupa ne pokazuju očite abnormalnosti ili oštećenja organa. 8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz RuDA-NP i RuDA grupa ne pokazuju očite abnormalnosti ili oštećenja organa.Kao što je prikazano na sl.8E, slike okrašenih H&E pet glavnih organa iz grupe RuDA-NPs i RuDA ne pokazuju javnu anomaliju ili oštećenja organa. 8E, H&E slike bojenja pet glavnih organa iz RuDA-NPs i RuDA grupa ne pokazuju očite abnormalnosti ili lezije organa.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Kao što je prikazano na slici 8E, slika okrašenja H&E pet glavnih organa iz skupine RuDA-NPs i RuDA nije pokazala javnu anomaliju ili oštećenje. Kao što je prikazano na slici 8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz RuDA-NPs i RuDA grupa nisu pokazale očite abnormalnosti ili oštećenja organa.Ovi rezultati su pokazali da ni RuDA-NP ni RuDA nisu pokazali znakove toksičnosti in vivo. Štoviše, slike tumora obojene H&E pokazale su da obje skupine RuDA + Laser i RuDA-NPs + Laser mogu uzrokovati ozbiljno uništavanje stanica raka, pokazujući izvrsnu in vivo fototerapijsku učinkovitost RuDA i RuDA-NPs. Štoviše, slike tumora obojene H&E pokazale su da obje skupine RuDA + Laser i RuDA-NPs + Laser mogu uzrokovati ozbiljno uništavanje stanica raka, pokazujući izvrsnu in vivo fototerapijsku učinkovitost RuDA i RuDA-NPs.Uz to, slike tumora obojene hematoksilinom-eozinom pokazale su da obje skupine RuDA+Laser i RuDA-NPs+Laser mogu izazvati ozbiljno uništavanje stanica raka, pokazujući superiornu fototerapijsku učinkovitost RuDA i RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 的 h & e 染色 图像 显示 ， ， ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 ， 证明 了 了 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 的 光疗 功效。。。 优异 体内 体内 光疗 功效。 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内 体内此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ， ， ， ， ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 癌 细胞 破坏 证明 了 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 光疗 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 . . . .Osim toga, slike tumora obojene hematoksilinom i eozinom pokazale su da su obje skupine RuDA+Laser i RuDA-NPs+Laser rezultirale teškim uništavanjem stanica raka, pokazujući superiornu fototerapijsku učinkovitost RuDA i RuDA-NPs in vivo.
U zaključku, Ru(II)-aren (RuDA) organometalni kompleks s ligandima tipa DA dizajniran je za olakšavanje ISC procesa korištenjem metode agregacije.Sintetizirani RuDA može se sam sastaviti putem nekovalentnih interakcija u obliku supramolekularnih sustava izvedenih iz RuDA, čime se olakšava stvaranje 1O2 i učinkovita fototermalna pretvorba za svjetlosno induciranu terapiju raka.Važno je napomenuti da monomerni RuDA nije generirao 1O2 pod laserskim zračenjem na 808 nm, ali je mogao generirati veliku količinu 1O2 u agregatnom stanju, pokazujući racionalnost i učinkovitost našeg dizajna.Naknadne studije su pokazale da supramolekularni sklop daje RuDA poboljšana fotofizička i fotokemijska svojstva, kao što su apsorpcija crvenog pomaka i otpornost na fotoizbjeljivanje, što je vrlo poželjno za PDT i PTT obradu.I in vitro i in vivo pokusi pokazali su da RuDA NP s dobrom biokompatibilnošću i dobrim nakupljanjem u tumoru pokazuju izvrsnu svjetlosno induciranu antikancerogenu aktivnost nakon laserskog zračenja na valnoj duljini od 808 nm.Stoga će RuDA NP kao učinkoviti bimodalni supramolekularni PDT/PTW reagensi obogatiti skup fotosenzibilizatora aktiviranih na valnim duljinama iznad 800 nm.Konceptualni dizajn supramolekularnog sustava pruža učinkovit put za NIR-aktivirane fotosenzibilizatore s izvrsnim učincima fotosenzibilizacije.
Sve kemikalije i otapala nabavljeni su od komercijalnih dobavljača i korišteni su bez daljnjeg pročišćavanja.RuCl3 je kupljen od Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) i 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol je sintetiziran prema prethodnim studijama64,65.NMR spektri su snimljeni na Bruker Avance III-HD 600 MHz spektrometru u Southeastern University Analytical Test Center koristeći d6-DMSO ili CDCl3 kao otapalo.Kemijski pomaci δ dani su u ppm.u odnosu na tetrametilsilan, a konstante interakcije J dane su u apsolutnim vrijednostima u hercima.Masena spektrometrija visoke rezolucije (HRMS) provedena je na Agilent 6224 ESI/TOF MS instrumentu.Elementarna analiza C, H i N provedena je na elementnom analizatoru Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-vidljivi spektri mjereni su na spektrofotometru Shimadzu UV3600.Fluorescencijski spektri su snimljeni na Shimadzu RF-6000 spektrofluorimetru.EPR spektri su snimljeni na instrumentu Bruker EMXmicro-6/1.Morfologija i struktura pripremljenih uzoraka proučavana je na instrumentima FEI Tecnai G20 (TEM) i Bruker Icon (AFM) koji rade na naponu od 200 kV.Dinamičko raspršenje svjetlosti (DLS) provedeno je na Nanobrook Omni analizatoru (Brookhaven).Fotoelektrokemijska svojstva mjerena su na elektrokemijskom uređaju (CHI-660, Kina).Fotoakustične slike dobivene su pomoću sustava FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Konfokalne slike dobivene su konfokalnim mikroskopom Olympus FV3000.FACS analiza provedena je na BD Calibur protočnom citometru.Eksperimenti tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) izvedeni su na sustavu Waters Alliance e2695 korištenjem 2489 UV/Vis detektora.Testovi gel permeacijske kromatografije (GPC) snimljeni su na instrumentu Thermo ULTIMATE 3000 pomoću ERC RefratoMax520 detektora indeksa loma.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) i ledena octena kiselina (30 mL) miješaju se u refluksnom hladnjaku 12 sati.Otapalo je zatim uklonjeno u vakuumu korištenjem rotacijskog isparivača.Dobiveni ostatak je pročišćen fleš kromatografijom na stupcu (silikagel, CH2Cl2:MeOH=20:1) da se dobije RuDA kao zeleni prah (prinos: 877,5 mg, 80%).anus.Izračunato za C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Nađeno: C 67,92, H 4,26, N 9,82.'H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 8 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, IH), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), Δ (ppm) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 106.21, 105.57, 134.68, 130., 130.02, 128. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Sinteza 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazola (L2): L2 je sintetiziran u dva koraka.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) dodan je u N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilin (1,05 g, 2,4 mmol) i 4,7-dibromo-5,6-dinitro otopina - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) u suhom toluenu (100 ml).Smjesa je miješana na 100°C 24 sata.Nakon uklanjanja toluena u vakuumu, dobivena krutina je isprana petroleterom.Zatim se smjesa ovog spoja (234,0 mg, 0,45 mmol) i željeznog praha (0,30 g, 5,4 mmol) u octenoj kiselini (20 ml) miješa na 80°C 4 sata.Reakcijska smjesa je izlivena u vodu i rezultirajuća smeđa krutina je sakupljena filtracijom.Produkt je pročišćen dva puta sublimacijom u vakuumu da se dobije zelena krutina (126,2 mg, 57% donos).anus.Izračunato za C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Nađeno: C 67,84, H 6,95, H 18,16.'H NMR (600 MHz, CDC13), 8 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13S NMR (150 MHz, CDC13), 8 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Spojevi su pripravljeni i pročišćeni slijedeći postupke slične RuDA.anus.Izračunato za C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Nađeno: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 8 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, IH), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (ppm) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.7.7., 121.7.7., 121.7., 128.35, 128., 118., 118., 128., 118., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA je otopljen u MeOH/H2O (5/95, v/v) u koncentraciji od 10 μM.Apsorpcijski spektar RuDA mjeren je svakih 5 minuta na Shimadzu UV-3600 spektrofotometru pod zračenjem laserskim svjetlom valne duljine od 808 nm (0,5 W/cm2).ICG spektri su snimljeni pod istim uvjetima kao i standard.
EPR spektri su snimljeni na spektrometru Bruker EMXmicro-6/1 s mikrovalnom snagom od 20 mW, rasponom skeniranja od 100 G i modulacijom polja od 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidon (TEMP) i 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksid (DMPO) korišteni su kao spin trapovi.Snimljeni su spektri elektronske spinske rezonancije za miješane otopine RuDA (50 µM) i TEMF (20 mM) ili DMPO (20 mM) pod djelovanjem laserskog zračenja valne duljine 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT i TD-DFT proračuni za RuDA provedeni su na razinama PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ u vodenoj otopini pomoću Gaussovog programa 1666,67,68.HOMO-LUMO, distribucija šupljina i elektrona niskoenergetskog singletnog pobuđenog stanja RuDA nacrtana je pomoću programa GaussView (verzija 5.0).
Prvo smo pokušali izmjeriti učinkovitost generiranja 1O2 RuDA koristeći konvencionalnu UV-vidljivu spektroskopiju s ICG (ΦΔ = 0,002) kao standardom, ali je fotodegradacija ICG-a snažno utjecala na rezultate.Stoga je kvantni prinos 1O2 RuDA izmjeren otkrivanjem promjene intenziteta ABDA fluorescencije na oko 428 nm kada je ozračen laserom valne duljine od 808 nm (0,5 W/cm2).Eksperimenti su provedeni na RuDA i RuDA NP (20 μM) u vodi/DMF (98/2, v/v) koji sadrži ABDA (50 μM).Kvantni prinos 1O2 izračunat je pomoću sljedeće formule: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS i rICG su brzine reakcije ABDA s 1O2 dobivene iz fotosenzibilizatora, odnosno ICG.APS i AICG su apsorbancija fotosenzibilizatora, odnosno ICG na 808 nm.
AFM mjerenja su provedena u tekućim uvjetima korištenjem načina skeniranja na Bruker Dimension Icon AFM sustavu.Koristeći otvorenu strukturu s tekućim stanicama, stanice su dvaput isprane etanolom i osušene strujom dušika.Umetnite osušene stanice u optičku glavu mikroskopa.Odmah stavite kap uzorka u bazen tekućine i stavite ga na konzolu pomoću sterilne plastične štrcaljke za jednokratnu upotrebu i sterilne igle.Još jedna kap stavlja se izravno na uzorak, a kada se optička glava spusti, dvije se kapi spajaju, tvoreći meniskus između uzorka i spremnika tekućine.AFM mjerenja provedena su korištenjem nitridne konzole SCANASYST-FLUID u obliku slova V (Bruker, tvrdoća k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC kromatogrami dobiveni su na Waters e2695 sustavu opremljenom phoenix C18 kolonom (250x4,6 mm, 5 µm) korištenjem 2489 UV/Vis detektora.Valna duljina detektora je 650 nm.Mobilne faze A i B bile su voda odnosno metanol, a brzina protoka mobilne faze bila je 1,0 ml·min-1.Gradijent (otapalo B) je bio kako slijedi: 100% od 0 do 4 minute, 100% do 50% od 5 do 30 minuta, i ponovno postavljeno na 100% od 31 do 40 minuta.Ruda je otopljena u miješanoj otopini metanola i vode (50/50, po volumenu) u koncentraciji od 50 μM.Volumen injekcije bio je 20 μl.
GPC testovi su snimljeni na Thermo ULTIMATE 3000 instrumentu opremljenom s dvije PL aquagel-OH MIXED-H kolone (2×300×7,5 mm, 8 µm) i ERC RefratoMax520 detektorom indeksa loma.GPC kolona je eluirana vodom pri brzini protoka od 1 ml/min na 30°C.Ore NPs su otopljeni u PBS otopini (pH = 7,4, 50 μM), volumen injekcije je bio 20 μL.
Fotostruje su mjerene na elektrokemijskom uređaju (CHI-660B, Kina).Optoelektronički odzivi kada je laser bio uključen i isključen (808 nm, 0,5 W/cm2) izmjereni su pri naponu od 0,5 V u crnoj kutiji.Korištena je standardna ćelija s tri elektrode s elektrodom od staklenog ugljika u obliku slova L (GCE) kao radnom elektrodom, standardnom kalomelnom elektrodom (SCE) kao referentnom elektrodom i platinastim diskom kao protuelektrodom.Kao elektrolit korištena je 0,1 M otopina Na2SO4.
Stanična linija ljudskog raka dojke MDA-MB-231 kupljena je od KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kina, kataloški broj: KG033).Stanice su uzgajane u jednom sloju u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM, visoka glukoza) dopunjenom otopinom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), penicilina (100 μg/ml) i streptomicina (100 μg/ml).Sve su stanice uzgajane na 37°C u vlažnoj atmosferi koja je sadržavala 5% CO2.
MTT test korišten je za određivanje citotoksičnosti RuDA i RuDA-NP u prisutnosti i odsutnosti svjetlosnog zračenja, sa ili bez Vc (0,5 mM).Stanice raka MDA-MB-231 uzgajane su u pločama s 96 jažica pri gustoći stanica od približno 1 x 105 stanica/ml/jažici i inkubirane su 12 sati na 37,0°C u atmosferi od 5% CO2 i 95% zraka.Stanicama su dodani RuDA i RuDA NP otopljeni u vodi.Nakon 12 sati inkubacije, stanice su bile izložene laserskom zračenju od 0,5 W cm-2 na valnoj duljini od 808 nm tijekom 10 minuta (300 J cm-2) i zatim inkubirane u mraku 24 sata.Stanice su zatim inkubirane s MTT (5 mg/ml) još 5 sati.Na kraju, promijenite medij u DMSO (200 µl) kako biste otopili nastale ljubičaste kristale formazana.Vrijednosti OD izmjerene su pomoću čitača mikropločica s valnom duljinom od 570/630 nm.Vrijednost IC50 za svaki uzorak izračunata je pomoću softvera SPSS iz krivulja doza-odgovor dobivenih iz najmanje tri neovisna eksperimenta.
Stanice MDA-MB-231 tretirane su s RuDA i RuDA-NP u koncentraciji od 50 µM.Nakon 12 sati inkubacije stanice su ozračene laserom valne duljine 808 nm i snage 0,5 W/cm2 10 minuta (300 J/cm2).U skupini s vitaminom C (Vc), stanice su tretirane s 0,5 mM Vc prije laserskog zračenja.Stanice su zatim inkubirane u mraku dodatnih 24 sata, zatim su obojene kalceinom AM i propidijevim jodidom (20 μg/ml, 5 μl) 30 minuta, zatim isprane PBS-om (10 μl, pH 7,4).slike obojenih stanica.