Vijesti

Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Stanice raka razvile su različite mehanizme za prevladavanje staničnog stresa i nastavak napredovanja.Protein kinaza R (PKR) i njezin proteinski aktivator (PACT) su početni odgovori koji prate različite signale stresa koji dovode do inhibicije stanične proliferacije i apoptoze.Međutim, regulacija puta PACT-PKR u stanicama raka ostaje uglavnom nepoznata.Ovdje smo otkrili da je duga nekodirajuća RNA (lncRNA) aspartil tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) izravno uključena u inhibiciju PACT-PKR puta i potiče proliferaciju stanica raka.Koristeći opsežni funkcionalni probir lncRNA CRISPRi 971 povezane s rakom, otkrili smo da je DARS-AS1 povezan sa značajno pojačanom proliferacijom stanica raka.Stoga, DARS-AS1 nokaut inhibira staničnu proliferaciju i potiče apoptozu stanica raka u različitim staničnim linijama raka in vitro te značajno smanjuje rast tumora in vivo.Mehanički, DARS-AS1 veže se izravno na PACT aktivacijsku domenu i sprječava PACT-PKR interakciju, čime se smanjuje PKR aktivacija, eIF2α fosforilacija i inhibicija apoptotičke stanične smrti.Klinički, DARS-AS1 je široko izražen u više vrsta raka, a prekomjerna ekspresija ove lncRNA ukazuje na lošu prognozu.Ova studija razjašnjava regulaciju PACT-PKR puta DARS-AS1 lncRNA specifičnu za rak i pruža još jednu metu za prognozu i liječenje raka.
Sposobnost prilagodbe stresu važna je karakteristika preživljavanja i proliferacije stanica raka.Brza proliferacija i metabolička obilježja raka dostižu vrhunac u oštrim mikrookruženjima - deprivacija hranjivih tvari, hipoksija i nizak pH - koji mogu pokrenuti signalne putove stanične smrti.Disregulacija gena osjetljivih na stres kao što su p535, proteini toplinskog šoka 6, 7, KRAS8, 9 i HIF-110, 11, 12, 13 često se uočava kod raka, čime se blokira apoptoza i promiče preživljavanje.
Protein kinaza R (PKR) važan je senzor stresa i podjedinica kinaze eukariotskog inicijacijskog faktora 2α (eIF2α), translacijskog regulatora koji povezuje stanični stres i staničnu smrt.PKR je izvorno identificiran kao antivirusni protein detekcijom strane dvolančane RNA (dsRNA).Nakon aktivacije, PKR fosforilira eIF2α kako bi inhibirao sintezu virusnih i staničnih proteina14,15,16.PACT (PKR aktivatorski protein) identificiran je kao prvi PKR aktivatorski protein u odsutnosti dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Izravnom interakcijom s PKR-om, PACT transducira različite stresove (izgladnjivanje seruma, tretman peroksidom ili arsenitom) na PKR i nizvodne signalne putove.Uz fosforilaciju eIF2α, aktivacija PKR-a posredovana PACT-om pokreće različite događaje povezane s odgovorom na stres, uključujući promijenjeni redoks status putem puta PI3K/Akt24, poboljšanu provjeru oštećenja DNK putem p5325,26 i NF-κB27,28 Regulira transkripciju, 29. S obzirom na njihovu ključnu ulogu u odgovoru na stres, proliferaciji, apoptozi i drugim ključnim staničnim procesima, PKR i PACT su obećavajuće terapijske mete za mnoge bolesti, osobito rak30,31,32,33.Međutim, unatoč ovom pleiotropnom funkcionalnom i biološkom značaju, regulacija aktivnosti PACT/PKR u stanicama raka ostaje nedostižna.
lncRNA su transkripti veći od 200 nukleotida bez potencijala kodiranja proteina.Budući da su vrhunski projekti sekvenciranja cijelog genoma identificirali tisuće lncRNA,35,36 uloženo je puno truda da se razjasne njihove biološke funkcije.Sve veći broj istraživanja pokazao je da su lncRNA uključene u mnoge biološke procese37 uključujući regulaciju inaktivacije X-kromosoma38,39, otiskivanje40, transkripciju41,42, translaciju43 pa čak i rast raka44,45,46,47.Ove studije su izvijestile da su mnoge lncRNA uključene u PACT/PKR put.Jedna takva studija pokazala je da lncRNA ASPACT inhibira PACT transkripciju i povećava nuklearno zadržavanje PACT mRNA.Druge studije su pokazale da se lncRNA nc886 veže za PKR i inhibira njegovu fosforilaciju49,50.Do sada nije zabilježena lncRNA koja regulira aktivaciju PKR posredovanu PACT-om.
Aspartil-tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) identificirana je kao onkogena lncRNA51,52,53,54.Kroz regulaciju miP-194-5p53, miP-12952 i miP-532-3p51, pokazalo se da DARS-AS1 potiče rast jasnostaničnog karcinoma bubrežnih stanica, karcinoma štitnjače i karcinoma pluća nemalih stanica.Tong i kolege također su otkrili da DARS-AS1 potiče napredovanje mijeloma održavanjem stabilnosti RNA-vezujućeg motiva proteina 39 (RBM39).Međutim, nisu provedene studije o tome je li ova lncRNA uključena u regulaciju PACT-PKR aktivacije i odgovor stanica raka na stres.
Ovdje smo proveli veliki pregled gubitka funkcije pomoću sustava CRISPRi i utvrdili da DARS-AS1 lncRNA potiče proliferaciju nekoliko vrsta stanica raka.Osim toga, identificirali smo glavni mehanizam: DARS-AS1 veže se izravno na PACT, inhibira vezanje PACT i PKR, sprječava fosforilaciju eIF2α, nižeg PKR supstrata, i u konačnici inhibira apoptotičku staničnu smrt.Zaključno, naš rad otkriva DARS-AS1 lncRNA kao regulator PACT-PKR puta i potencijalnu metu za liječenje i prognozu raka.
Opsežne studije genomskog profiliranja identificirale su stotine lncRNA povezanih s rakom.Međutim, njihova je funkcija uglavnom nepoznata56.Kako bismo identificirali obećavajuće kandidate za lncRNA koji su uključeni u progresiju raka, proveli smo pregled gubitka funkcije za smanjenu proliferaciju u staničnoj liniji SW620 kolorektalnog karcinoma pomoću sustava CRISPRi (Slika 1a).Jedinstvena značajka SW480 i SW620 staničnih linija raka debelog crijeva je da su izvedene iz primarnih i sekundarnih tumora kod jednog pacijenta.Ovo daje vrijednu usporedbu za proučavanje genetskih promjena u napredovanju uznapredovalog raka debelog crijeva.Stoga smo analizirali transkriptome staničnih linija raka debelog crijeva (SW480 i SW620) korištenjem RNA sekvenciranja i prikupili neke potencijalne funkcionalne lncRNA iz objavljene literature.Na temelju ovih rezultata dizajnirali smo združenu biblioteku sgRNA koja sadrži 7355 sgRNA oligoa koji ciljaju 971 lncRNA povezanu s rakom i 500 neciljanih sgRNA oligoa za negativnu kontrolu (Dopunski podaci 1).
Shematski prikaz probira pomoću sustava CRISPRi.b obogaćivanje sgRNA nakon probira.Vodoravna točkasta linija predstavlja log2 (promjena puta) = ±0,58.Okomita točkasta linija označava p vrijednost = 0,05.Crne točke predstavljaju neciljanu sgRNA (označenu kao NC).Crvene točke su sgRNA koje ciljaju DARS-AS1.Plave točke su sgRNA koje ciljaju LINC00205, prethodno opisanu onkogenu lncRNA.promjena puta = (normalizirano očitanje, dan 17)/(normalizirano očitanje, dan 0).c DARS-AS1 sgRNA nokdaun inhibira rast stanica.Stupci pogrešaka predstavljaju ± standardnu ​​devijaciju tri eksperimenta.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvostrani Studentov t-test.d Ekspresija DARS-AS1 u tumorima (set podataka TCGA).em Ekspresija DARS-AS1 u uparenim normalnim i tumorskim uzorcima pacijenata s BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, odnosno COAD (TCGA skup podataka).p-vrijednosti su dobivene korištenjem uparenog dvostranog Studentovog t-testa.
Nakon konstruiranja plazmida i pakiranja lentivirusa, transducirali smo dCas9-SW620 staničnu liniju raka debelog crijeva s gornjom bibliotekom u četiri neovisna eksperimenta infekcije.Mnoštvo infekcija (MOI) za ove infekcije iznosilo je 0,1-0,3, što ukazuje da se svaka stanica može transficirati samo jednom sgRNA.Nakon 18 dana kulture in vitro, profil obogaćivanja ciljnih sgRNA smanjio se ili povećao nakon probira, dok je broj neciljanih kontrolnih oligonukleotida ostao relativno nepromijenjen u usporedbi s profilom prije probira, što ukazuje da naš cilj ima visoko specifičan probir knjižnica.Riža.1b i dodatna tablica 1). LINC00205, za koji je prethodno objavljeno da potiče progresiju raka pluća i raka jetre 58, 59, 60, izdvojen je (log2 (promjena puta) < -0,58, p vrijednost < 0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog pregleda (Slika 1b). LINC00205, za koji je prethodno objavljeno da potiče progresiju raka pluća i raka jetre 58, 59, 60, izdvojen je (log2 (promjena puta) < -0,58, p vrijednost < 0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog pregleda (Slika 1b). LINC00205, o kojem je ranije javljeno, moguće je napredovanje raka lakih i raka pečenih 58, 59, 60, isključeno (log2 (kratka promjena) <-0,58, vrijednost p <0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog skrininga (ris 1b). LINC00205, za koji je prethodno objavljeno da potiče progresiju raka pluća i raka jetre58,59,60, isključen je (log2 (promjena puta) <-0,58, p-vrijednost <0,05), potvrđujući robusnost ovog pregleda (Sl. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 报道 可 促进 肺癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （掉 （掉 （掉 （变化）） <-0.58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 可靠性 （（（（（图 （（（（（（（（（（（图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 （（（（（ LINC00205 之前 被 报道 报道 可 促进 肺癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （掉 （掉 （掉 （变化）） <-0.58 ， p 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 可靠性 （（（（（图 （（（（（（（（（（（图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 图 （（（（（ LINC00205, o kojem je ranije javljeno, moguće je napredovanje raka lakih i pečenih 58, 59, 60, isključeno (log2 (kratka promjena) <-0,58, p-značenje <0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog skrininga (ris 1b). LINC00205, za koji je prethodno objavljeno da potiče progresiju raka pluća i jetre58,59,60, bio je isključen (log2 (promjena puta) <-0,58, p-vrijednost <0,05), potvrđujući robusnost ovog pregleda (Slika .1b).
Među svim testiranim lncRNA, DARS-AS1 je također pregledan, s tri srodna sgRNA oligonukleotida značajno smanjenim nakon 18 dana kulture, što sugerira da je obaranje ove lncRNA rezultiralo smanjenom proliferacijom raka (Slika 1b).Ovaj rezultat dodatno je poduprla MTS analiza u stanicama raka debelog crijeva koja je pokazala da je stopa rasta oborenih stanica DARS-AS1 samo prepolovljena u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 1c) i bila je u skladu s prethodnim izvješćima o nekoliko drugih vrsta raka.: svijetlostanični rak bubrega, rak štitnjače i rak pluća nemalih stanica51,52,53,55.Međutim, njegova funkcija i molekularni mehanizmi u kolorektalnom karcinomu ostaju neistraženi.Stoga smo odabrali ovu lncRNA za daljnje proučavanje.
Kako bismo proučili ekspresiju DARS-AS1 kod pacijenata, sveobuhvatno smo analizirali 10 327 uzoraka tumora iz projekta Atlas genoma raka (TCGA).Naši rezultati pokazuju da je DARS-AS1 široko izražen i značajno pojačan u zdravim stanicama u različitim tumorima, uključujući adenokarcinom debelog crijeva (COAD), karcinom svijetlih stanica bubrega (KIRC) i karcinom bubrežnih papilarnih stanica (KIRP)..Vrlo malo (slika 1d i dopunska slika 1a, b). Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka dodatno je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćnog mjehura (BLCA), bubrežnog karcinoma svijetlih stanica (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih stanica pluća (LUSC) , karcinom endometrija tijela maternice (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom bubrežnih papilarnih stanica (KIRP) i adenokarcinom debelog crijeva (COAD) (p vrijednost < 0,05) (Slika 1e–m) . Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka dodatno je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćnog mjehura (BLCA), bubrežnog karcinoma svijetlih stanica (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih stanica pluća (LUSC) , karcinom endometrija tijela maternice (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom bubrežnih papilarnih stanica (KIRP) i adenokarcinom debelog crijeva (COAD) (p vrijednost < 0,05) (Slika 1e–m) .Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka također je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćnog mjehura (BLCA), karcinoma bubrega svijetlih stanica i karcinoma bubrežnih stanica (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih stanica pluća (LUSC)., karcinom endometrija tijela matice (UCEC), adenokarcinom lakšeg (LUAD), hepatocelularni karcinom pečenja (LIHC), papilarno-ćelijski karcinom kože (KIRP) i adenokarcinom tolste kičme (COAD) (značenje p <0,05) (ris. 1e– m) . , karcinom endometrija corpus uteri (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom papilarnih stanica bubrega (KIRP) i adenokarcinom debelog crijeva (COAD) (p vrijednost < 0,05) (Slika 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 了 了 了 了 了 了 了s1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的 的 的 肺鳞状 肺鳞状 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （（（（（） 肝肝 细胞癌 细胞癌 （（（（（（（（肾 肾 乳头状 乳头状 细胞癌 （kirp） 和结肠腺癌 （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 的 分析 证实 了 了 了 了 了 在 尿路 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Analiza uparenih uzoraka zdravih/tumora dodatno je poduprla ulogu DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćnog mjehura (BLCA), karcinoma bubrežnih stanica svijetlih stanica (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD) i karcinoma skvamoznih stanica pluća (LUSC).ekspresija pri karcinomu tijela matice (UCEC), adenokarcinomu lakšeg (LUAD), hepatocelularnom karcinomu (LIHC), početno-počečnom papilarno-ćelijskom karcinomu (KIRP) i adenokarcinomu tolste sluznice (COAD) (značenje p <0,05) (ris. 1e). -m). ekspresija u karcinomu tijela maternice (UCEC), adenokarcinomu pluća (LUAD), hepatocelularnom karcinomu (LIHC), karcinomu bubrežnih papilarnih stanica (KIRP) i adenokarcinomu debelog crijeva (COAD) (p vrijednost <0,05) (Slika 1e-m).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da je DARS-AS1 široko i visoko izražen u različitim vrstama raka.
Budući da DARS-AS1 i DARS (gen koji kodira antisense lanac) dijele isti promotor i smješteni su jedan pored drugoga, dizajnirali smo shRNA da specifično obori DARS-AS1, ali ne i DARS (dodatna slika 2a,b i dopunska tablica 2) .Uz SW620, također smo upotrijebili tri druge stanične linije s visokom ekspresijom DARS-AS1 za proučavanje učinkovitosti i funkcije nokdauna shRNA (dodatna tablica 3).Naši rezultati su pokazali da su sve tri razvijene shRNA postigle najmanje 80% učinkovitosti obaranja DARS-AS1 s malim učinkom na količinu DARS mRNA (dodatna slika 2c-f).Osim toga, otkrili smo da je DARS-AS1 nokdaun ovim shRNA značajno inhibirao rast stanica u staničnim linijama raka debelog crijeva SW620 (49,7%) i HCT116 (27,7%), staničnoj liniji raka dojke MBA-MD-231 (53,4%).) i staničnu liniju hepatoma HepG2 (smanjenje od 92,7%), kao i njihovu sposobnost stvaranja neusidrenih sfera (prosječno smanjenje od ~50,8%, 44,6%, 40,7% i 75,7% po liniji stanica) (Sl. 2a,b).U SW620, rezultati testa stvaranja kolonija dodatno su potvrdili da DARS-AS1 shRNA značajno inhibira staničnu proliferaciju s prosječnim smanjenjem od približno 69,6% (slika 2c).
Učinak kontrolne shRNA i DARS-AS1 shRNA na staničnu proliferaciju (a) i formiranje sferoida (b) u stanicama SW620, HCT116, MBA-MD-231 i HepG2.c Učinak kontrolne shRNA i DARS-AS1 shRNA na stvaranje kolonija u stanicama SW620.Proliferacija stanica (d), stvaranje sferoida (e) i stvaranje kolonija (f) stanica SW620 koje prekomjerno izražavaju DARS-AS1.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 i *** p ≤ 0,001 pomoću dvosmjernog Studentovog t-testa.
Kako bismo nadopunili studije gubitka funkcije, zatim smo stvorili SW620 stanice koje prekomjerno izražavaju DARS-AS1 (dodatna slika 2g).Prekomjerna ekspresija DARS-AS1 značajno je povećala rast stanica (1,8 puta), stvaranje neusidrenih sferoida (1,4 puta) i stvaranje kolonija (3,3 puta) u stanicama SW620 (Slika 2d-f).Potvrdili smo ovaj rezultat korištenjem druge stanične linije s ekspresijom DARS-AS1, A549.Ova pojačana stanična proliferacija zbog prekomjerne ekspresije DARS-AS1 nadalje je opažena u stanicama A549 (dodatna slika 2h, i i dopunska tablica 3).Uzete zajedno, ove studije dobitka i gubitka pokazuju da DARS-AS1 potiče proliferaciju stanica raka in vitro.
Kako bismo istražili temeljni mehanizam kojim DARS-AS1 regulira staničnu proliferaciju, proveli smo padajuću analizu RNA kako bismo identificirali njegove potencijalne partnere za vezanje proteina.Rezultati RT-qPCR-a pokazali su da se oko 86,2% DARS-AS1 nalazi u citoplazmi stanica SW620 (dodatna slika 3a).In vitro transkribirana biotinilirana DARS-AS1 ili pseudoRNA je zatim inkubirana sa lizatima stanica SW620 nakon čega je uslijedilo odvajanje SDS-PAGE.Naknadno bojenje srebrom pokazalo je da je jasna traka (~38 kDa) značajno obogaćena u uzorcima DARS-AS1 izvlačenja, ali ne i u uzorcima lažne RNA ili kuglica (Slika 3a).Ta je traka identificirana kao PKR aktivirajući protein (PACT) pomoću spektrometrije mase (MS) i dodatno potvrđena imunoblotingom u SW620, HCT116 i HepG2 staničnim linijama (Slika 3a,b).Obogaćivanje DARS-a i srodnih PACT proteina – PKR i TRBP – također je istraženo analizom RNA metodom Western blotting (WB).Rezultati su pokazali da nije pronađena izravna interakcija između DARS-AS1 RNA i ova tri proteina (dodatna slika 3b).Specifična interakcija između DARS-AS1 i PACT dodatno je potvrđena analizom RNA imunoprecipitacije (RIP), koja je pokazala da je DARS-AS1 značajno obogaćen anti-PACT protutijelima, ali ne i drugim kontrolnim RNA (Slika 3c).Kako bi se utvrdilo stupa li DARS-AS1 u izravnu interakciju s PACT-om u odsutnosti bilo koje druge stanične komponente, provedeno je in vitro ispitivanje bioslojne interferometrije (BLI) korištenjem pročišćenog PACT-a.Biotinom obilježena DARS-AS1 ili lažna RNA imobilizirana je na biosenzore streptavidina (SA) i zatim inkubirana u kinetičkom puferu koji sadrži 1 µM PACT.Naime, PACT se snažno vezao za DARS-AS1 (KD vrijednost ~26,9 nM), ali ne i za oponašanje RNA (Slika 3d).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju izravnu interakciju i visok afinitet između DARS-AS1 i PACT.
Analiza povlačenja RNA identificirala je DARS-AS1 u interakciji s PACT u stanicama SW620.Gore, srebrno bojenje srodnih proteina.Donji imunoblotovi su izvedeni s anti-PACT antitijelima.b Analiza padajuće RNA provedena je u stanicama HCT116 (gore) i HepG2 (dolje).PACT obogaćivanje otkriveno je imunoblotingom.Ispitivanje cRNA imunoprecipitacije (RIP) provedeno je u SW620 stanicama korištenjem navedenih protutijela.d PACT krivulje vezanja na DARS-AS1 pune duljine ili kontrolnu RNA dobivene su interferometrijom biosloja (BLI).RNA je imobilizirana na streptavidinskom biosenzoru.Za mjerenje povezanosti korišten je 1 μM PACT.Test povlačenja RNA proveden je korištenjem biotiniliranog DARS-AS1 pune duljine ili skraćenog (gore).Imunoblot koji pokazuje primljeni PACT (dno).f Pročišćeni označeni PACT je inkubiran s biotiniliranim DARS-AS1 pune duljine ili skraćenim (kao u e) za in vitro RIP test.Ekstrahirana RNA je verificirana RT-qPCR.g Relativni afinitet različitih fragmenata RNA za PACT dobiven je interferometrijom biosloja.Za analizu je korišteno 100 nM RNA i 1 μM RAST.h In vitro RIP testovi provedeni su upotrebom pročišćenog intaktnog ili skraćeno obilježenog PACT-a.Ekstrahirana RNA je verificirana RT-qPCR.i Brzina rasta stanica SW620 koje prekomjerno izražavaju DARS-AS1, PACT ili oboje.j Prekomjerna ekspresija punog ili skraćenog DARS-AS1 u stanicama SW620 imala je različite učinke na rast stanica.k Apoptoza je otkrivena imunoblotingom s anti-PARP antitijelima.l Izbacivanje DARS-AS1 inducira apoptozu stanica SW620 kao što je prikazano protočnom citometrijom.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 prema dvostranom kriteriju Stjudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvostranim Studentovim t-testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 prema dvostranom kriteriju Stjudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvostranim Studentovim t-testom.
Zatim smo generirali tri biotinilirana DARS-AS1 RNA fragmenta in vitro transkripcijom kako bismo identificirali DARS-AS1 regiju potrebnu za PACT povezanost (Slika 3e).Rezultati analize RNA pokazali su da je svaki fragment bio u mogućnosti komunicirati s PACT-om, ali 3'-terminalna regija (384-768 nukleotida označenih A3) pokazala je više od 1-384 nukleotida označenih A1) (Slika 3e).Slični rezultati primijećeni su u in vitro RIP testu korištenjem rekombinantnog PACT-a (Slika 3f).U skladu s ovim rezultatima, eksperimenti za vezanje imobiliziranih fragmenata RNA na PACT pomoću BLI također su pokazali da PACT ima veći afinitet za A3 (384–768 nt) (KD vrijednost od približno 94,6 nM), dok gotovo da nema poveznica s drugim područjima.(Slika 3d).
Također smo ispitali povezane vezne regije u PACT-u.PACT sadrži tri funkcionalne domene, od kojih su dvije konzervirane dvolančane RNA-vezujuće domene (dsRBD) i treću domenu (označenu D3) koja djeluje kao aktivator proteinskih interakcija.Kako bismo ispitali sposobnost vezanja lncRNA svake domene, projektirali smo tri mutacije koje su uklonile svaku od tri domene i proveli in vitro RIP test.Naši su rezultati pokazali da je brisanje treće domene (D3) PACT-a značajno smanjilo njegovu interakciju s DARS-AS1 (za 0,11 puta u usporedbi s intaktnim PACT-om) u usporedbi s druge dvije mutacije (Sl. 3h), pokazalo se da oslobađanje od D3 komunicirao s DARS-om.-AC1.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da se interakcija između DARS-AS1 i PACT-a može dogoditi prvenstveno kroz 3' kraj DARS-AS1 i D3 domene PACT-a.
Primijetili smo da DARS-AS1 nije imao učinka na ekspresiju PACT-a, a PACT nije imao učinka na DARS-AS1 (dodatna slika 3c).Zatim smo ispitali učinak PACT nokdauna na rast stanica.Za razliku od DARS-AS1, relativne stanice rasle su 1,5-3 puta brže kada je PACT oboren (dodatna slika 3d).Rezultati testa formiranja kolonija pokazali su da su stanice formirale 2-3 puta veće kolonije nakon tretmana shRNA s PACT-om (dopunska slika 3e).Kako bismo testirali regulira li DARS-AS1 staničnu proliferaciju putem PACT-a, generirali smo stanice SW620 koje prekomjerno izražavaju PACT, DARS-AS1 ili oboje.Prekomjerna ekspresija PACT-a pokazala je značajnu inhibiciju stanične proliferacije (Slika 3i).Dok je prekomjerna ekspresija DARS-AS1 per se značajno pospješila staničnu proliferaciju, nije bilo značajne razlike u stopi rasta stanica koje su prekomjerno eksprimirale DARS-AS1 i PACT.Ovi rezultati sugeriraju da PACT može spriječiti povećanu proliferaciju uzrokovanu prekomjernom ekspresijom DARS-AS1.
Budući da različite regije DARS-AS1 imaju različite sposobnosti vezanja PACT-a, istražili smo njihov relativni utjecaj na staničnu proliferaciju različitom prekomjernom ekspresijom fragmenata DARS-AS1.U usporedbi s druga dva fragmenta, DARS-AS1 je bio prekomjerno izražen na 3' kraju (384-768 nt), glavnoj regiji povezanoj s PACT-om u DARS-AS1, koja je imala najveću sposobnost stimuliranja stanične proliferacije (Slika 3j).Ovi rezultati ukazuju na pozitivnu korelaciju između kapaciteta vezanja i biološke funkcije DARS-AS1.
Prijavljeno je da je PACT pro-apoptotski protein19.Stoga smo istražili učinak DARS-AS1 na apoptozu.Kao što se očekivalo, DARS-AS1 nokdaun značajno je povećao PARP cijepanje u SW620 stanicama i povećao udio aneksin V-pozitivnih stanica u SW620, HCT116, HepG2 i MBA-MD-231 staničnoj liniji (Slika 3k).3).3f-h), što ukazuje da je anti-apoptotski učinak DARS-AS1 u stanicama raka suprotan funkciji PACT-a koja izaziva apoptozu.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da bi mehanizam onkogene funkcije DARS-AS1 mogao biti kroz inhibiciju funkcije PACT.
Zatim smo istražili funkcionalne implikacije povezanosti DARS-AS1-PACT.Prijavljeno je da PACT aktivira PKR kroz izravnu interakciju, koja naknadno pojačava fosforilaciju eIF2α, uzrokujući translacijsku deleciju i apoptozu17.Prvo smo ispitali utječe li DARS-AS1 na staničnu lokalizaciju PACT-a i PKR-a.Konfokalna fluorescentna mikroskopija pokazala je da su PACT i PKR visoko kolokalizirani u stanicama SW620 s prosječnim Pearsonovim koeficijentom korelacije od 0,72.U međuvremenu, prekomjerna ekspresija DARS-AS1 značajno je smanjila ko-lokalizaciju PACT i PKR (srednji Pearsonov koeficijent korelacije 0,61) (Slika 4a).Kako bismo istražili može li DARS-AS1 modulirati PACT-PKR interakciju, proveli smo test ko-imunoprecipitacije (co-IP) s anti-PACT antitijelima u lizatima stanica SW620.PKR je bio visoko obogaćen anti-PACT-om u kontrolnim stanicama, dok je oporavak PKR-a bio značajno smanjen u lizatima iz stanica koje prekomjerno izražavaju DARS-AS1 (Slika 4b).Pročišćeni označeni PACT i PKR korišteni su za in vitro testove vezanja proteina.Sukladno tome, oni koji su dali DARS-AS1, ali ne i kontrolnu RNA, pokazali su potisnutu interakciju PACT-PKR (Slika 4c).Svi rezultati su pokazali da je DARS-AS1 poremetio PACT i PKR komunikaciju.
Ko-lokalizacija PACT-a i PKR-a u kontrolnim stanicama ili stanicama s prekomjernom ekspresijom DARS-AS1 opažena je pomoću konfokalne fluorescentne mikroskopije.Jezgre su obojene s DAPI.Statistički rezultati dobiveni su iz 16 fotografija.b Ko-imunoprecipitacija (co-IP) korištenjem anti-PACT antitijela u staničnim lizatima kontrolnih SW620 stanica ili stanica koje prekomjerno izražavaju DARS-AS1.c Označeni PACT, pročišćeni PKR i transkribirani in vitro s DARS-AS1 ili lažnom RNA inkubirani su za in vitro analizu vezanja proteina.Anti-flag antitijela korištena su za imunoprecipitaciju.d Imunoblotovi s navedenim antitijelima izvedeni su u stanicama SW620 i HCT116 transficiranim kontrolnom shRNA ili DARS-AS1-shRNA nakon čega je uslijedilo izgladnjivanje seruma.e Razine ekspresije DARS-AS1 promijenile su staničnu osjetljivost na tapsigargin.Stanice SW620 transficirane su DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 prekomjerno ekspresijskim plazmidom ili kontrolnim plazmidom.Stanice su tretirane tapsigarginom 48 sati i vijabilnost stanica određena je korištenjem MTS reagensa.f In vitro transkribirani DARS-AS1 ili lažna RNA i pročišćeni PACT korišteni su za in vitro aktivacijski test i imunoblot detekciju.g Imunoblotovi korištenjem ovih protutijela izvedeni su na stanicama SW620-ctrl (lijevo) ili stanicama s prekomjernom ekspresijom PKR mutanata (desno).Ove su stanice zatim transficirane kontrolnom shRNA ili DARS-AS1-shRNA nakon čega je uslijedilo izgladnjivanje seruma.h Protočna citometrija pokazala je da inaktivacija mutantnog PKR kompenzira apoptozu izazvanu DARS-AS1 u stanicama SW620.i Imunoblotovi s naznačenim protutijelima izvedeni su u stanicama SW620 (lijevo) ili HCT116 (desno).Stanice transficirane kontrolnom shRNA ili DARS-AS1 shRNA lišene su seruma i dopunjene su 100 nM PKR C16 inhibitorom ili DMSO.Mjerna traka = 5 µm.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta.* p ≤ 0,05 dvostrani Studentov t-test.
Općenito se vjeruje da kada PACT stupi u interakciju s PKR17, može se inducirati fosforilacija PKR na Thr451.Naši rezultati su pokazali da je razina fosforilacije PKR bila značajno povišena u DARS-AS1 nokdaun stanicama nakon izgladnjivanja seruma (Slika 4d i Dodatna slika 4a).Sukladno tome, otkrili smo da je fosforilacija eIF2α, glavnog PKR supstrata, također značajno povećana DARS-AS1 shRNA (Slika 4d i Dodatna slika 4a).Thapsigargin je ER stresor koji uzrokuje ER oslobađanje Ca2+.Zabilježeno je da liječenje tapsigarginom inducira ekspresiju i aktivaciju PACT-a, koji dalje stupa u interakciju s PKR i aktivira ga, što dovodi do apoptoze povećanjem fosforilacije eIF2α 18,61.Ovdje smo upotrijebili tapsigargin kao stimulator PACT/PKR puta kako bismo istražili može li DARS-AS1 pomoći stanicama da prevladaju stres inhibicijom PACT/PKR puta.Uočili smo da je razina ekspresije DARS-AS1 u pozitivnoj korelaciji s otpornošću stanica na tapsigargin.Stanice SW620 s prekomjernom ekspresijom DARS-AS1 preživjele su bolje kada su tretirane tapsigarginom, dok su stanice s nokdaunom DARS-AS1 postale osjetljivije (Slika 4e).U skladu s ovim rezultatima, prekomjerna ekspresija DARS-AS1 smanjila je fosforilaciju PKR induciranu tapsigarginom (dodatna slika 4b).Nasuprot tome, nakon tretmana tapsigarginom, PKR i eIF2α bili su fosforilirani u većoj mjeri u DARS-AS1 knockdown stanicama u usporedbi s kontrolnim stanicama (dodatna slika 4b).Zanimljivo je da je thapsigargin inducirao ekspresiju DARS-AS1 na način ovisan o dozi, što može ukazivati ​​na antistresnu funkciju DARS-AS1 (dodatna slika 4c).Osim toga, proveli smo in vitro testove aktivacije kako bismo potvrdili ta opažanja.Ukratko, PKR je pročišćen iz staničnih lizata pomoću anti-PKR antitijela, zatim inkubiran s rekombinantnim PACT i DARS-AS1 transkribiranim in vitro.Nakon enzimske reakcije, fosfo-PKR je detektiran pomoću WB.Naši rezultati pokazuju da je fosforilacija PKR značajno inhibirana DARS-AS1, ali ne i kontrolnom RNA (Slika 4f).Ovi in ​​vitro i in vivo rezultati sugeriraju da DARS-AS1 inhibira aktivaciju PKR-a posredovanu PACT-om.U isto vrijeme, također smo primijetili smanjenje PACT oporavka u prisutnosti DARS-AS1 (Slika 4f).Ovaj je rezultat u skladu s rezultatima in vitro testa vezanja proteina (Slika 4c) i ponovno ilustrira funkciju blokiranja DARS-AS1 za povezanost PACT-PKR.
Ser246 i Ser287 u D3 domeni PACT-a potrebni su za aktivaciju PKR pod staničnim stresom.Supstitucija dva serinska ostatka alaninom dala je mutirani PACT (mutD), koji je aktivirao PKR u odsutnosti stresa, a supstitucija alaninom (mutA) preokrenula je protokol.Budući da smo pokazali važnost ove domene u izravnoj povezanosti s DARS-AS1, generirali smo ova dva PACT mutanta da testiramo mogu li ti ostaci također biti uključeni u interakciju s DARS-AS1.Zanimljivo je da su oba mutanta izgubila sposobnost vezanja na DARS-AS1 (dopunska slika 4d), što sugerira da bi potpuna struktura proteina PACT mogla biti potrebna za učinkovitu interakciju s DARS-AS1.
Nadalje, naši rezultati također sugeriraju da se inhibicija stanične proliferacije izazvana DARS-AS1-shRNA može djelomično obnoviti prekomjernom ekspresijom dominantno negativnog PACT mutanta (PACTmutA) ili dominantno negativnog PKR mutanta (PKRmut) (dodatna slika 4e. e).Prekomjerna ekspresija dominantno negativnih PKR mutanata smanjila je fosforilaciju PKR induciranu DARS-AS1 nokdaunom, kao i fosforilaciju eIF2α u stanicama lišenim seruma (Slika 4g).Što je još važnije, udio apoptotskih stanica izazvanih DARS-AS1 nokdaunom također je smanjen u stanicama koje prekomjerno izražavaju PKRmut (Slika 4h i Dodatna slika 4g).Inhibicija aktivnosti PKR kinaze također oštećuje funkciju DARS-AS1, budući da su rezultati pokazali da je rušenje DARS-AS1 rijetko pokrenulo fosforilaciju PKR i eIF2α kada su stanice tretirane PKR-specifičnim inhibitorom C16 (Slika 4i i Dodatna slika 4h).).Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da DARS-AS1 potiče proliferaciju stanica, barem djelomično, inhibicijom aktivacije PKR-a posredovane PACT-om.
Kako bismo dalje istražili ulogu DARS-AS1 u tumorogenezi, proveli smo in vivo pokuse koristeći model mišjeg ksenografta. Rezultati pokazuju da je nokdaun DARS-AS1 dramatično smanjio rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a). Rezultati pokazuju da je nokdaun DARS-AS1 dramatično smanjio rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a). Rezultati pokazuju da nokdaun DARS-AS1 rezko smanjuje rast puhanja u mišu (značenje p <0,0001) (slika 5a). Rezultati pokazuju da nokdaun DARS-AS1 drastično smanjuje rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Rezultati su pokazali da je nokdaun DARS-AS1 značajno smanjio rast puhanja u mišu (značenje r <0,0001) (slika 5a). Rezultati su pokazali da je nokdaun DARS-AS1 značajno smanjio rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a).Stoga je u nokdaun skupini DARS-AS1 došlo do značajnog smanjenja prosječnog volumena tumora za oko 72,9% i srednje mase tumora za oko 87,8% (Slika 5b-d).Ovi rezultati snažno sugeriraju da DARS-AS1 može značajno potaknuti rast tumora in vivo.
Učinci ad DARS-AS1 nokdauna na kolorektalnu onkogenezu u golih miševa.Prikazane su krivulje rasta (a), veličina tumora (b), težina (c) i slike tumora (d).Trake pogrešaka predstavljaju ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001 prema dvostranom kriteriju Stjudenta. n = 10. ****p < 0,0001 dvostrani Studentov t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 prema dvostranom kriteriju Stjudenta. ****p < 0,0001 dvostrani Studentov t-test.e Kaplan-Meier analizirao je korelaciju između razina ekspresije DARS-AS1 i ukupnog preživljenja u pacijenata s UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM i LGG.Visoke razine ekspresije DARS-AS1 kod pacijenata bile su u prvih 50%;niska razina ekspresije DARS-AS1 kod pacijenata bila je u donjih 50%.p-vrijednosti su određene pomoću log rank testa.f Predloženi model u kojem DARS-AS1 regulira PACT-PKR put i rast tumora.
Kako bismo bolje razumjeli klinički učinak DARS-AS1, ispitali smo korelaciju između njegove ekspresije i preživljenja pacijenata.Analizom skupa podataka TCGA otkrili smo da je veća ekspresija DARS-AS1 povezana s melanomom uvee (UVM), renalnom kromofobijom (KICH), karcinomom bubrežnih papilarnih stanica (KIRP), mezoteliomom (MESO), multipleksom.Niže preživljenje bilo je značajno povezano s morfozom glioblastoma (GBM) i pacijentima s gliomom mozga niskog stupnja (LGG) (Slika 5e).Ovi rezultati sugeriraju da DARS-AS1 može igrati važnu ulogu u kliničkoj progresiji tumora i može biti potencijalni prediktivni biomarker kod više vrsta raka.
U ovoj smo studiji, koristeći CRISPRi funkcionalni probir velikih razmjera, utvrdili da DARS-AS1 lncRNA prevladava stres stanica raka reguliranjem dva ključna odgovora na stres, PACT i PKR.Izravnom interakcijom s PACT-om, DARS-AS1 je inhibirao aktivaciju PKR-a posredovanu PACT-om, čime je spriječio apoptotičku staničnu smrt i poticao staničnu proliferaciju (Slika 5f).Pojačana regulacija DARS-AS1 primijećena je u više vrsta raka, što sugerira da se njegova funkcija promicanja preživljavanja stanica raka u stresnim uvjetima može široko primijeniti na više vrsta raka.
PACT je identificiran kao PKR aktivatorski protein, a PACT-om posredovana PKR aktivacija igra važnu ulogu u odgovorima na stres reguliranjem transkripcije, translacije, apoptoze i drugih važnih staničnih procesa62.Desetljećima se pokušava razumjeti regulacija PACT-PKR kaskade specifična za rak.Ovdje je naša studija otkrila drugačiji mehanizam regulacije PACT-PKR u stanicama raka putem stanične lncRNA DARS-AS1, koja se izravno veže na PACT, blokira interakciju PACT-PKR, inhibira aktivaciju PKR i fosforilaciju eIF2α, čime inhibira apoptozu izazvanu stresom i stimulirajući eventualnu proliferaciju raka.Stanice.Ovo otkriće baca svjetlo na potencijalne mete lncRNA za prognozu i terapiju raka.
Naši podaci su pokazali da obaranje DARS-AS1 senzibilizira stanice na izgladnjivanje seruma sa značajnim povećanjem fosforiliranog PKR i eIF2α.Ovi rezultati sugeriraju da DARS-AS1 potiče preživljavanje stanica raka u teškim uvjetima inhibicijom aktivnosti PACT/PKR.Nekoliko drugih nekodirajućih RNA, kao što su ASPACT i nc886, također je uključeno u os PACT/PKR snižavanjem PACT48 mRNA ili reguliranjem autofosforilacije vezanjem na PKR49,50,64.Među njima, DARS-AS1 djeluje kao disruptor PACT-PKR asocijacije.Ova studija obogaćuje naše razumijevanje regulacije osi PACT/PKR i uloge lncRNA u reakcijama na stres.
PACT sadrži tri odvojene domene.Svaki od prva dva dsRBD dovoljan je za postizanje visokog afiniteta vezanja PACT-a na PKR, dok je treća domena (D3) potrebna za aktivaciju PKR-a in vitro i in vivo.Naša je studija pokazala da DARS-AS1 preferirano stupa u interakciju s D3 domenom (slika 3h).S obzirom na veliku veličinu lncRNA (768 nukleotida), DARS-AS1 vezanjem na D3 može fizički inhibirati interakciju između PACT domene dsRBD i PKR, blokirajući tako povezanost PACT i PKR.PACT točkaste mutacije koje su zamijenile Ser246 i Ser287 u D3 s alaninom ili aspartatom poremetile su njegov afinitet vezanja za DARS-AS1, ukazujući na važnost ukupnih strukturnih i električnih svojstava D3 u njihovoj povezanosti.Daljnji detalji ovog mehanizma bit će potrebni u budućnosti, korištenjem preciznije biokemijske analize i PACT strukturne analize visoke rezolucije.
Prethodne studije su izvijestile da DARS-AS1 potiče proliferaciju stanica kroz nekoliko mehanizama51,52,53.U jednom primjeru, istraživači su primijetili da je DARS-AS1 pojačao svoj DARS gen koji kodira antisense protein ciljajući miP-194-5p u stanice raka bubrega.Međutim, u ovoj studiji, nokdaun DARS-AS1 imao je mali učinak na transkripciju DARS-a u više vrsta raka, uključujući barem kolorektalni rak, rak dojke i jetre.Budući da lncRNA pokazuju obrasce ekspresije specifične za stanice i tkiva, funkcionalni mehanizmi možda neće biti očuvani među vrstama raka, što može pridonijeti ovom odstupanju između naših opažanja i prethodnih procjena različitih vrsta raka.Potrebna su posebna istraživanja kako bi se razjasnili specifični mehanizmi različitih fizioloških i patoloških procesa.
Analiza kliničkih podataka pokazala je da je ekspresija DARS-AS1 u tumorima u obrnutoj korelaciji s preživljenjem pacijenata oboljelih od raka, što naglašava važnost osi DARS-AS1/PACT/PKR u prognozi raka.Zaključno, naša studija pokazuje da je DARS-AS1 regulator PACT/PKR signalne osi, potiče proliferaciju stanica raka i inhibira apoptozu tijekom odgovora na stres, što pruža još jednu liniju istraživanja i od interesa je za buduća istraživanja potencijalnih tretmana .
Ljudske stanične linije SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 i HEK293T dobivene su od National Cell Line Resource Infrastructure u Kini.Sve su stanice održavane u mediju DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) s dodatkom 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) i 1% penicilin-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) na 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normalni mišji IgG, CST (5415S);normalni zečji IgG, CST (2729S).Antitijela su razrijeđena 1:1000 u PBST za Western blotting i 1:100 za IP.
sgRNA razvijene su korištenjem javno dostupnog alata pod nazivom CRISPR-ERA66.Koristili smo zadane parametre alata za razvoj sgRNA, a algoritam je izračunao mjesta vezivanja sgRNA u regiji od 3 kb.sa središtem u TSS.Skupovi sgRNA oligonukleotida sintetizirani su u CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) i klonirani u humanizirane pgRNA plazmide (Addgene #44248).Ukupno 12 µg združenog humaniziranog pgRNA plazmida, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) i 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) kotransficirano je u 5 x 106 HEK293T u posudama od 10 cm pomoću DNAfect Transfection Reagensa ćelije (CWBIO, Peking, Kina) prema uputama proizvođača.Supernatanti koji sadrže virus sakupljeni su 48 i 72 sata nakon transfekcije i filtrirani kroz filter od 0,45 µm.Za probir, stanice SW620 koje eksprimiraju fuzijski protein dCas9/KRAB dobivene su transdukcijom virusa.Modificirane SW620 stanice zaražene su bibliotekom virusa u četiri neovisna eksperimenta infekcije pri MOI od 0,1-0,3 i uzorkovane su s 2 μg/ml puromicina (Sigma, St. Louis, MO) tijekom 2 dana.Nakon toga, stanice su uzgajane 18 dana in vitro s minimalnom pokrivenošću knjižnice od 500 stanica/sgRNA za probir.
Genomska DNK ekstrahirana je prema uputama QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Njemačka; 51183).Ukupno je 100 μg genomske DNA po biološkom ponavljanju korišteno za izgradnju knjižnice.Regija sgRNA pojačana je s dvije runde PCR-a i povezana s barkodom.
PCR proizvodi su pročišćeni korištenjem NucleoSpin® gela i PCR pribora za pročišćavanje (MACHEREY-NAGEL, Düren, Njemačka; 740609.250) i kvantificirani korištenjem Qubit™ HS kompleta za detekciju dvolančane DNA (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS test korišten je za mjerenje stanične proliferacije.Stanice su nasađene u ploče s 96 jažica pri početnoj gustoći od 2000 stanica/jažici.Relativni broj stanica mjeren je dnevno u navedeno vrijeme tijekom ukupno 4-6 dana.Za svaku jažicu 20 μl MTS reagensa (Promega) razrijeđeno je sa 100 μl DMEM, inkubirano sa stanicama 4 h na 37°C, a zatim je izmjeren OD490.
Sposobnost neusidrenog rasta otkrivena je analizom formiranja sfera.Ukratko, 2000 stanica transficiranih shRNA DARS-AS1 ili kontrolnom shRNA uzgojeno je u mikropločicama s ultra niskim pričvršćivanjem (Corning) s promjenom medija svaka 4 dana.Sferoidi su izbrojani nakon 14 dana.500 stanica transficiranih plazmidom prekomjerne ekspresije DARS-AS1 ili kontrolnim plazmidom korišteno je za analizu poboljšanja, inače je metoda ostala nepromijenjena.
RNA je transkribirana pomoću T7 RNA polimeraze i biotin-16-UTP (Roche 1138908910) prema uputama Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Ovdje korišteni primeri navedeni su u Dodatnoj tablici 4.
PACT ili PKR regije koje kodiraju protein klonirane su u pET15b (Addgene #73619) i transformirane u BL21(DE3).Bakterije su inkubirane preko noći u LB opskrbljenom ampicilinom i zatim razrijeđene 100 puta sa svježim LB.Kada je OD600 medija dosegao 0,8, dodan je 1 mM IPTG da se inducira ekspresija proteina.Nakon inkubacije preko noći uz lagano mućkanje (250 okretaja u minuti na 20°C), stanični talog je sakupljen centrifugiranjem (4000 okretaja u minuti, 10 minuta, 4°C).Resuspendirajte talog stanica u puferu za lizu (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) i inkubirajte na ledu 30 minuta, zatim sonikirajte (15 minuta, 5 s uključeno/isključeno, na ledu) i centrifugirajte (13 000 broj okretaja u minuti)., 30 min, 4°S).Supernatant je zatim napunjen na Ni-NTA smolu (QIAGEN) 3 puta na 4°C, ispran 4 puta puferom za ispiranje (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazola, 250 mM NaCl) i eluiran 3 puta, s ukupnim 10 ml pufera za ispiranje (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Pročišćeni protein je određen pomoću WB, a koncentracija je određena pomoću kompleta za analizu proteina Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testovi su izvedeni kao što je prethodno opisano, s modifikacijama.Ukratko, 1x RIP pufer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin inhibitor ribonukleaze (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaza) lizira citostatik 1 x 107 koktel (Roche, 1 mM DTT) i centrifugirajte na 13 000 okretaja u minuti 15 minuta na 4 °C.Supernatant je zatim inkubiran s magnetskim kuglicama proteina A+G (Millipore) konjugiranim s 5 μg anti-PACT antitijela (Abeam) ili IgG (CST).Kuglice su isprane 5 puta s 5x RIP puferom, zatim digestirane proteinazom K (NEB).RNA je ekstrahirana s Trizolom i određena RT-qPCR.Primeri su prikazani u Dodatnoj tablici 5.
In vitro RIP test proveden je prema modificiranom standardnom RIP test protokolu.Ukupno 5 pmol in vitro transkribirane RNA razrijeđeno je 1x s RIP puferom i žareno inkubacijom na 65°C tijekom 5 minuta nakon čega je uslijedilo polagano hlađenje na sobnu temperaturu.Ukupno 5 pmola intaktnih ili mutiranih PACT proteina obilježenih zastavicama pročišćeno je iz E. coli.Inkubirajte s renaturiranom RNA 2 sata na 4°C i slijedite gornji postupak za RIP analizu za anti-flag IP.
Za analizu ekstenzije RNA, 1×107 stanica je lizirano s 1xRIP puferom.Nakon centrifugiranja na 13 000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4 °C, supernatant je prethodno tretiran s 30 μl streptavidinskih magnetskih kuglica (Beckman) tijekom 2 sata na 4 °C.Pročišćeni lizat je zatim opskrbljen tRNA kvasca i inkubiran s 40 pmol renaturirane RNA preko noći na 4°C, zatim još 2 sata i dodano je 20 μl novih magnetskih kuglica streptavidina blokiranih s BSA.Korak ispiranja sastojao se od 4 puta s 5x RIP puferom i 4 puta s 1x RIP puferom.Odgovarajući proteini su eluirani puferom za ispiranje biotina (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) i odvojeni na NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen).Nakon bojenja srebrom (Beyotime Biotechnology), određene trake su izrezane i analizirane MS-om.
Provedena je Co-IP analiza kako bi se testirala interakcija između PACT-a i PKR-a.Ukratko, lizati supernatanta pripremljeni su inkubiranjem 1 x 107 liziranih stanica u 1 x RIP puferu nakon čega je slijedilo centrifugiranje na 13 000 okretaja u minuti tijekom 15 minuta na 4°C.Lizati su napunjeni magnetskim kuglicama proteina A + G, konjugiranim s 5 µg anti-PACT antitijela, i lagano rotirani preko noći na 4°C.Kuglice su isprane 3 puta s 5 x RIP puferom, dva puta s 1 x RIP puferom i eluirane s 1 x SDS puferom.Oporavljeni protein je analiziran pomoću SDS-PAGE gela i detektiran pomoću WB.
Dva pmola označenog PACT-a i 1 pmol PKR-a su pročišćeni iz E. coli.Razrijedite u 1× RIP puferu i inkubirajte s 10 pmol renaturirane RNA 2 sata na 4 °C.Nakon toga su inkubirani s anti-obilježenim antitijelima konjugiranim magnetskim kuglicama proteina A+G dodatna dva sata.Kuglice su zatim isprane četiri puta s 1x RIP puferom i eluirane s 1x SDS puferom.Rezultirajući PACT i PKR otkriveni su WB-om.